[發(fā)明專利]斑馬魚多發(fā)性硬化癥模型的建立方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210016072.6
• 申請(qǐng)日: 2012-01-18
• 公開（公告）號(hào): CN102600156A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李春?jiǎn)?/a>;朱曉宇;朱鳳;郭勝亞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州環(huán)特生物科技有限公司
• 主分類號(hào): A61K31/473
• 分類號(hào): A61K31/473;A61P37/02;G01N21/64
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于藥物篩選(評(píng)價(jià))領(lǐng)域，具體涉及一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高通量的斑馬魚多發(fā)性硬化癥模型的建立方法，并利用該動(dòng)物模型篩選多發(fā)性硬化癥治療藥物或評(píng)價(jià)化合物誘導(dǎo)的神經(jīng)髓鞘損傷的方法。?

背景技術(shù)

多發(fā)性硬化癥(multiple?sclerosis，MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)樘攸c(diǎn)的自身免疫病，可能是遺傳易感個(gè)體與環(huán)境因素作用而發(fā)生的神經(jīng)免疫過(guò)程，由于其發(fā)病率較高，成慢性病程和傾向于年輕人罹患，而成為最重要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一^[1]。流行病學(xué)顯示該病在北美洲約有40萬(wàn)例患者，我國(guó)約有6.5萬(wàn)例患者，全球的患者超過(guò)100萬(wàn)例，女性患者多于男性，多發(fā)于20-40歲年齡段的人群^[2]。MS新藥研發(fā)是國(guó)際主要制藥公司新藥研發(fā)的重點(diǎn)項(xiàng)目之一。盡管目前臨床已經(jīng)有多種MS治療藥物，包括激素類、免疫調(diào)節(jié)類、免疫抑制類、他汀類藥物等，但是這些藥物對(duì)MS的療效有限，且毒副作用大，費(fèi)用高，因此迫切需要研發(fā)新的MS治療藥物^[3]。?

MS病理?yè)p傷機(jī)制與T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)，膽堿能神經(jīng)的功能異常，胞漿型磷脂酶A2、激肽釋放酶等酶的激活和大量自由基釋放等密切相關(guān)^[4]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為MS是由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，即人體對(duì)其自身組織發(fā)動(dòng)免疫攻擊而造成發(fā)病。MS的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental?allergic?encephalomyelitis，EAE)也證實(shí)激活的T細(xì)胞啟動(dòng)了MS的炎性過(guò)程導(dǎo)致脫髓鞘等病變，并伴隨炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)和炎性介質(zhì)釋放，產(chǎn)生大量自由基、細(xì)胞因子及趨化因子等活性物質(zhì)。這些活性物質(zhì)可以直接成為發(fā)病的原因或加重因素，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central?nervous?system，CNS)血管及組織的完整性破壞和功能異常^[2-5]。?

EAE的臨床表現(xiàn)及病理改變與急性多發(fā)性硬化癥極其相似，因而成為研究MS免疫病理學(xué)機(jī)制及其實(shí)驗(yàn)性治療的最佳動(dòng)物模型^[6]。EAE是一種人工誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性自身免疫疾病，可以在多種動(dòng)物品系中誘導(dǎo)產(chǎn)生。EAE可?以通過(guò)主動(dòng)免疫脊髓組織勻漿誘導(dǎo)產(chǎn)生，或經(jīng)免疫弗氏完全佐劑乳化的髓鞘抗原蛋白如髓鞘堿性蛋白、蛋白脂蛋白或髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白，也可經(jīng)被動(dòng)注入髓鞘抗原反應(yīng)活性的T細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生^[7-14]。雖然EAE是經(jīng)典的研究MS的方法，但該模型實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、成本高、特異性不強(qiáng)、重復(fù)性差、且無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量藥物篩選的目的。?

目前還沒有合適的研究髓鞘的體外細(xì)胞模型。有研究曾采用背根神經(jīng)節(jié)(DOG)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的方法來(lái)探索髓鞘形成過(guò)程中生長(zhǎng)因子對(duì)髓鞘形成的影響^[15-16]。但細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)體系的建立耗時(shí)較長(zhǎng)，方法不穩(wěn)定，重復(fù)性差，尚不適宜進(jìn)行體外高通量MS治療藥物篩選，并且體外細(xì)胞缺少藥物在生物整體的代謝轉(zhuǎn)化和體內(nèi)的循環(huán)分布，不能反映藥物在體內(nèi)的真實(shí)情況^[17]。因此建立一種能很好的模擬藥物在體內(nèi)的過(guò)程，又能快速方便的評(píng)價(jià)與篩選多發(fā)性硬化癥治療藥物的動(dòng)物模型具有重要意義。?

斑馬魚是一種新穎的模式生物。與傳統(tǒng)的體內(nèi)和體外篩選模型相比較，活體斑馬魚篩選模型具有諸多優(yōu)勢(shì)，克服了原有體外模型在吸收、分布、代謝和排泄環(huán)節(jié)驗(yàn)證的欠缺及傳統(tǒng)體內(nèi)篩選模型實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、成本高的弊端。斑馬魚是一種脊椎動(dòng)物，與人類基因的相似度高達(dá)85％左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性強(qiáng)。與鼠類等哺乳動(dòng)物相比，斑馬魚胚胎透明，可同時(shí)觀察分析多個(gè)器官，實(shí)驗(yàn)周期短，樣本容量大，結(jié)果可信度高，所需費(fèi)用低^[18]。更重要的是，斑馬魚模型具有與生俱來(lái)的優(yōu)點(diǎn)^[18-19]：①飼養(yǎng)成本低，性成熟周期短；②繁殖能力強(qiáng)，一尾雌魚每次可產(chǎn)200～300枚卵；③生長(zhǎng)發(fā)育速度快，在受精后24小時(shí)(24hpf)，斑馬魚主要的組織器官原基已形成，可為研究提供大量的樣本和較短的實(shí)驗(yàn)周期；④胚胎及幼魚透明，體外受精，體外發(fā)育，可直接觀察，并可同時(shí)分析多個(gè)器官系統(tǒng)；⑤胚胎有可以提供營(yíng)養(yǎng)的卵黃，第一周內(nèi)不需喂食，可避免化合物處理時(shí)化合物與食物成份的相互作用；⑥胚胎體積小，幼魚體長(zhǎng)只有1-4mm，能夠在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的6、12、24、48或96孔板內(nèi)進(jìn)行分析；⑦給藥方式簡(jiǎn)單：溶于水的小分子物質(zhì)可直接經(jīng)皮膚、鰓及消化系統(tǒng)進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)；不溶于水的物質(zhì)、大分子物質(zhì)及蛋白質(zhì)可進(jìn)行顯微注射。因此斑馬魚可作為很好的評(píng)價(jià)與篩選藥物的高通量體內(nèi)脊椎動(dòng)物模型。?