[發(fā)明專利]一種基于Figla基因的超表達促進細胞向雌性生殖細胞分化的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210015998.3
• 申請日: 2012-01-18
• 公開（公告）號: CN102533778A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡玥;華進聯(lián)
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;C12N5/10
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

1.一種Figla基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.基于Figla基因序列構(gòu)建的表達載體，其特征在于，包括SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因，在Figla基因的下游連接熒光報告基因。

3.如權(quán)利要求2所述的基于Figla基因序列構(gòu)建的表達載體，其特征在于，還在熒光標(biāo)記基因的下游連接抗生素篩選基因。

4.如權(quán)利要求3所述的基于Figla基因序列構(gòu)建的表達載體，其特征在于，所述的熒光標(biāo)記基因為DsRed，抗生素篩選基因為neor。

5.如權(quán)利要求2所述的基于Figla基因序列構(gòu)建的表達載體，其特征在于，所述的基于Figla基因序列構(gòu)建的表達載體為pDsRed1-N1-Figla表達載體，通過Ecor?I和Bgl?II酶切位點將Figla基因克隆到pDsRed1-N1表達載體中。

6.Figla基因被標(biāo)記后轉(zhuǎn)染多能性干細胞以促進多能性干細胞向雌性生殖細胞分化或轉(zhuǎn)分化的應(yīng)用。

7.一種通過表達外源Figla基因促進細胞向雌性生殖細胞轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)克隆如SEQ.ID.NO.1所示的Figla基因序列，并將Figla基因序列通過Ecor?I和Bgl?II酶切位點克隆到pDsRed1-N1表達載體，得到pDsRed1-N1-Figla表達載體；

2)將pDsRed1-N1-Figla表達載體轉(zhuǎn)染到細胞中；轉(zhuǎn)染后用以下誘導(dǎo)液進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)液為：H-DMEM培養(yǎng)基+0.1mmol/Lβ-巰基乙醇+2mmol/L?L-谷氨酰胺+1％體積濃度的非必需氨基酸+15％體積濃度的FBS；

3)誘導(dǎo)后，通過免疫熒光染色和RT-PCR進行生殖特異性基因表達的檢測；篩選已分化的雌性生殖細胞。

8.如權(quán)利要求7所述的通過表達外源Figla基因促進細胞向雌性生殖細胞轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，所述的細胞包括P19和傳代培養(yǎng)的多能性干細胞；

多能性干細胞的傳代為將多能性干細胞接種到以10μg/mL絲裂霉素C處理2h的2～5代小鼠胎兒成纖維細胞作為飼養(yǎng)層的細胞培養(yǎng)板上，37℃、5％CO₂飽和濕度條件下培養(yǎng)，待克隆增殖到65～70％融合時傳代；

培養(yǎng)液為H-DMEM培養(yǎng)液+0.1mmol/Lβ-巰基乙醇+2mmol/L?L-谷氨酰胺+1％體積濃度的非必需氨基酸+10ng/mL白血病抑制因子+15％體積濃度的胎牛血清。

9.如權(quán)利要求8所述的通過表達外源Figla基因促進細胞向雌性生殖細胞轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，所述的多能性干細胞包括胚胎干細胞、誘導(dǎo)型多能性干細胞或成年組織來源的具有胚胎干細胞特性的多能性干細胞。