[發明專利]3-咪唑基酪氨酸翻譯系統及其應用

有效

• 申請號: 201210015550.1
• 申請日: 2012-01-18
• 公開（公告）號: CN103215235A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 王江云;劉曉紅;胡誠;江歡歡
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12P21/02;C12N1/21;C07K14/805;C12R1/19
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

1.正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列選自由SEQ?ID?NO：2所示氨基酸和它們的保守性變體構成的組。

2.一種3-咪唑基酪氨酸翻譯系統，所述系統包含：

(i)3-咪唑基酪氨酸；

(ii)權利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；

(iii)正交tRNA，其包含SEQ?ID?NO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-咪唑基酪氨酸優先氨酰化所述正交tRNA；和

(iv)編碼目標蛋白質的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子。

3.如權利要求2所述的翻譯系統，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述選擇密碼子是琥珀密碼子。

4.如權利要求2所述的翻譯系統，其還包含編碼正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。

5.一種宿主細胞，其包含所述正交tRNA序列和編碼所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。

6.如權利要求5所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是真細菌細胞，優選大腸桿菌細胞。

7.一種產生在至少一個所選位置定點特異插入3-咪唑基酪氨酸的突變蛋白質的方法，所述方法包括下述步驟：

(a)提供權利要求2所述的3-咪唑基酪氨酸翻譯系統，該系統包含：

(i)3-咪唑基酪氨酸；

(ii)權利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；

(iii)正交tRNA，其包含SEQ?ID?NO：1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-咪唑基酪氨酸優先氨酰化所述正交tRNA；和

(iv)編碼所述目標蛋白質的核酸，其中所述核酸在所選的位置包含所述正交tRNA特異性識別的至少一個選擇密碼子；和

(b)將編碼所述目標蛋白質的核酸轉化到權利要求5所述的宿主細胞中，在所述蛋白質的翻譯期間，3-咪唑基酪氨酸氨酰化的正交tRNA對所述選擇密碼子起反應而將培養基中的3-咪唑基酪氨酸定點特異插入所述目標蛋白質的所述所選位置，從而產生在所選位置含3-咪唑基酪氨酸的所述目標蛋白質。

8.如權利要求7所述的方法，其中所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述選擇密碼子是琥珀密碼子。

9.生產含有3-咪唑基酪氨酸的肌紅蛋白突變體的方法，其利用權利要求7所述的方法，其中所用的編碼肌紅蛋白突變體的核酸序列為SEQ?ID?NO：7，在野生型肌紅蛋白的33位引入3-咪唑基酪氨酸，同時將29位亮氨酸突變為組氨酸，所述肌紅蛋白突變體的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：6。

10.由權利要求9所述的方法獲得的含有3-咪唑基酪氨酸的肌紅蛋白突變體，所述肌紅蛋白突變體的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：6，在野生型肌紅蛋白的33位引入3-咪唑基酪氨酸，同時將29位亮氨酸突變為組氨酸，所述肌紅蛋白突變體在適宜的條件下產生氧化酶活性。