[發(fā)明專利]特異性檢測禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210015001.4
• 申請日: 2012-01-18
• 公開（公告）號: CN102559900A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高必達(dá);夏花
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 長沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 何為;袁穎華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種大孢指疫霉菌(Sclerophthora?macrospora)的檢測方法，具體涉及一種特異性檢測禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)。

背景技術(shù)

大孢指疫霉菌是指疫霉屬的一種真核菌，屬于卵菌綱，此綱的成員的有性階段產(chǎn)生卵孢子。此菌寄生于多種禾本科植物，易引起霜霉病。水稻受霜霉病危害之后心葉淡黃、卷曲、不易抽出，下部老葉逐漸枯死，植株矮縮，不能抽穗或花器畸形，在局部地區(qū)造成嚴(yán)重?fù)p失。

水稻霜霉病的診斷一般首先從癥狀上初步判斷，再用顯微鏡檢查病組織，如果檢查到病菌卵孢子即確定為陽性。但檢查到卵孢子時(shí)用藥防治為時(shí)已晚，即便植株可以抽穗，也不能正常結(jié)實(shí)。而早期的癥狀不易與除草劑藥害和病毒病相區(qū)分。因此有必要建立一種早期檢測技術(shù)，對未鏡檢到卵孢子的疑似病株進(jìn)行診斷。

在植物病原物的檢測上，PCR是一種準(zhǔn)確、高效、應(yīng)用最廣的技術(shù)，但應(yīng)用于大孢指疫霉菌的檢測方面，尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決技術(shù)問題是：針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性檢測禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR方法，其依據(jù)大孢指疫霉菌已經(jīng)報(bào)告的核糖體大亞基RNA基因序列來設(shè)計(jì)特異性PCR引物，建立起PCR診斷技術(shù)體系，可檢測到多種禾本科植物如水稻、玉米等上的大孢指疫霉菌，解決水稻霜霉病早期檢測難的問題。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種特異性檢測禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR方法，該方法是以大孢指疫霉菌特異性引物對待測樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后電泳鑒定，該特異性引物為：

正向引物：5’-AGAATGCAGCGCTAAGC-3’(如SEQ?ID?No：1所示)

(對應(yīng)于EU826119.1的第207-223個(gè)堿基)，

反向引物：5’-ATGCGCATCCACTCAGC-3’(如SEQ?ID?No：2所示)

(對應(yīng)于EU826119.1的第629-613個(gè)堿基)。

詳述如下：

一、引物的設(shè)計(jì)：

發(fā)明人根據(jù)真核生物核糖體RNA基因堿基序列的特異性，從NCBI/GenBank搜索并下載大孢指疫霉菌HUH?892菌系核糖體大亞基RNA基因堿基序列(GenBank：EU826119.1共846個(gè)堿基)，只得到一條序列。

依據(jù)此序列用primerBLAST工具設(shè)計(jì)特異性PCR引物序列如下：

正向引物：5’-AGAATGCAGCGCTAAGC-3’

(對應(yīng)于EU826119.1的第207-223個(gè)堿基)

反向引物：5’-ATGCGCATCCACTCAGC-3’

(對應(yīng)于EU826119.1的第629-613個(gè)堿基)；

上述引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為423個(gè)堿基。

將正向引物和反向引物分別經(jīng)BLAST檢索，見圖1和圖2。結(jié)果表明：與正向引物序列和反向引物序列均100％覆蓋且堿基100％相同的只有EU826119.1。

二、病菌的PCR過程(以水稻來進(jìn)行說明)：

DNA的提取：按常規(guī)方法對疑似感染大孢指疫霉菌的水稻植株提取基因組DNA。

用上述設(shè)計(jì)的引物對對提取的疑似感染大孢指疫霉菌的水稻植株總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段約為423bp。

PCR擴(kuò)增體系(25μl)：DNA擴(kuò)增模板1μl、10×PCR?Buffer?2.5μl、dNTPs(10mm)0.5μl、Taq酶(2.5μ/μl)0.5μl、Forward?Primer(10mm)1μl、Reverse?Primer(10mm)1μl、及dd?H₂O?18.5μl。

擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃5min；循環(huán)參數(shù)：94℃30sec；56℃40sec；72℃40sec；共30個(gè)循環(huán)；72℃10min延伸。

三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定：

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)電泳并用凝膠成像系統(tǒng)檢查，結(jié)果出現(xiàn)的條帶與預(yù)期的大小相符，見圖3。

PCR產(chǎn)物送由寶生物工程(大連)有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST，只找到作為引物設(shè)計(jì)基礎(chǔ)的EU826119.1，見圖4。

本文中提及的PCR技術(shù)包含從PCR衍生的所有技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光PCR。