[發明專利]一步法構建攜帶外源基因的D24纖維蛋白修飾的條件復制型腺病毒載體及其應用

無效

• 申請號: 201210014951.5
• 申請日: 2012-01-18
• 公開（公告）號: CN102586327A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 夏海濱;李星
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

1.一種一步法構建的攜帶外源基因的D24纖維蛋白修飾的條件復制型腺病毒載體，其特征在于，重組腺病毒載體Ad5?E1A中的24bp堿基缺失，該類型重組腺病毒載體可以在pRB?null/mutant的腫瘤細胞中特異性復制；采用同源重組的方法將Ad5腺病毒基因組位于Hexon上第21468bp～21573bp的BamHI進行突變；在Ad5腺病毒基因組第31042bp處插入的修飾纖維蛋白為5/3，5/6，5/7，5/11，5/35序列中的任意一個；在Ad5腺病毒基因組fiber和E4之間即在Ad5腺病毒基因組第32788bp～32913bp處引入兩個單一的酶切位點BamHI、SfuI，在Ad5腺病毒基因組引入的兩個單一酶切位點之間插入一個用于篩選的表達元件；在Ad5腺病毒基因組引入的兩個單一酶切位點之間插入雙向表達框，該雙向表達框攜帶一個報告基因和一個治療基因，得到攜帶外源基因的D24纖維蛋白修飾的條件復制型腺病毒載體。

2.如權利要求1所述的攜帶外源基因的D24纖維蛋白修飾的條件復制型腺病毒載體，其特征在于，所說的24bp堿基缺失的位置在腺病毒基因組的第922bp～947bp，堿基缺失序列為cttacctgccacgaggctggcttt。

3.如權利要求1所述的攜帶外源基因的D24纖維蛋白修飾的條件復制型腺病毒載體，其特征在于，所述的篩選的表達元件是用于藍白斑篩選的β-半乳糖苷酶基因表達元件，即在細菌中表達的用于篩選的熒光蛋白表達元件、氨芐青霉素表達元件、卡那霉素表達元件、氯霉素表達元件中的任意一種。

4.如權利要求1所述的攜帶外源基因的D24纖維蛋白修飾的條件復制型腺病毒載體，其特征在于，所述攜帶的報告基因是綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、熒光素酶、β-半乳糖苷酶基因中的任意一種。

5.如權利要求1所述的攜帶外源基因的D24纖維蛋白修飾的條件復制型腺病毒載體，其特征在于，所述攜帶的治療基因是TRAIL，IL-24，IL-12，IFN，p53，arresten，endostatin中的任意一種。

6.權利要求1所述的攜帶外源基因的D24纖維蛋白修飾的條件復制型腺病毒載體一步法構建方法，其特征在于，具體按下述步驟構建：

(1)用酶切連接的方法構建Ad5?E1A分子中24個堿基缺失的穿梭載體：

以Ad5基因組質粒為模板，經過重疊聚合酶鏈式反應獲得含有Ad5?E1A分子中24bp堿基缺失的基因片段；將聚合酶鏈式反應片段與pGEMT-T?easy載體連接，將連接產物轉化DH5α細胞，經堿性裂解法提取質粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆，將所獲得陽性克隆命名為pGEMT/Ad5-D24F；

將Ad5-D24F片段從pGEMT/Ad5-D24F上經PacI和SpeI雙酶切下來，與用PacI和SpeI雙酶切處理的腺病毒E1穿梭載體(AdEasy?vector?pShuttle)進行連接，連接產物轉化DH5α細胞、提取質粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pHBD24?shuttle，此載體為獲得的pAd5?E1A?24bp缺失的穿梭載體；

(2)構建pHBD24-backbone：

將ScaI線性化的pHBD24?shuttle穿梭載體與ClaI線性化腺病毒骨架載體pTG3602/SwaI按摩爾比3∶1配制，共轉化感受態細胞BJ5183，經堿性裂解法提取質粒DNA，經酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得的陽性克隆即為Ad5?E1A分子中24個堿基缺失的腺病毒載體骨架，命名為pHBD24-backbone；

(3)構建定點突變六聯體蛋白高可變區5中的BamHI位點的pHBD24-backbone：

以腺病毒Ad5基因組為模板，通過PCR的方法獲得六聯體蛋白高可變區5序列下游2300bp的同源臂序列，連于pGEM-T?easy載體上，獲得pGEMT/Hexon?HR?down-1；

以pGEMT/Hexon?HR?down-1為模板，采用PCR反應定點突變六聯體蛋白高可變區5下游同源臂序列中的BamHI位點，獲得的陽性克隆命名為pGEMT/Hexon?BM；

將SwaI線性化的pHBD24-backbone和pGEMT/Hexon?BM按摩爾比1∶6配制，共轉化感受態細胞BJ5183，經堿性裂解法提取質粒DNA，經酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得的陽性克隆即為pHBD24BM；

(4)構建引入單一酶切位點BmaHI的腺病毒纖維蛋白修飾序列的3’上游2.0kb同源臂的質粒載體：

以腺病毒Ad5基因組DNA為模板，通過PCR擴增獲得引入單一酶切位點的Ad5纖維蛋白修飾的5’端上游2.0kb的片段，反應擴增產物經質量濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段；將回收的聚合酶鏈式反應產物分別與pGEMT-easy載體連接，經堿性裂解法提取質粒DNA，通過酶切及測序鑒定獲得陽性克隆為引入單一酶切位點BamHI的腺病毒纖維蛋白序列5’上游2.0kb同源臂的質粒載體，命名為pGEMT/fiber?up-BamHI；合成Ad5的Tail以及纖維蛋白嵌合體的Shaft和Knob序列，在Ad5的Tail序列上含有NdeI位點，在纖維蛋白修飾序列的Knob?3’端引入SpeI位點，通過NdeI和SpeI雙酶切，將此序列克隆到pshuttle?Ad5-E4-fiber載體的相應的酶切位點中，所獲得的新載體稱為pGEMT/fiber?chimeric?up?BamHI；

(5)構建引入單一酶切位點SfuI的腺病毒E4序列3’上游2.0kb同源臂的質粒載體：

以腺病毒Ad5基因組DNA為模板，通過PCR擴增獲得引入單一酶切位點的Ad5?E4區3’端上游2.0kb的片段，反應擴增產物經質量濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳后回收片段；將回收的聚合酶鏈式反應產物分別與pGEMT-easy載體連接，經堿性裂解法提取質粒DNA，通過酶切及測序鑒定獲得陽性克隆為引入單一酶切位點SfuI的腺病毒E4序列3’上游2.0kb同源臂的質粒載體，命名為pGEMT/E4up-SfuI；

(6)構建腺病毒fiber-E4部位攜帶篩選基因的穿梭載體：

以pUC19載體為基礎，在氨芐抗性基因的開放讀碼框的兩端通過基因突變的方式產生兩個單一的酶切位點XbaI及SfuI，然后將卡那抗性基因克隆到XbaI和SfuI的位點中，所獲得的卡那抗性載體與EcoRI-HindIII?linker連接，獲得的載體命名為pUCKanEHL；

將fiber?up和E4up分別從pGEMT/fiber?chimeric?up?BamHI和pGEMT/E4?up-SfuI上經對應的內切酶雙酶切下來，再依次連入pUCKanEHL，經堿性裂解法提取質粒DNA、酶切鑒定，獲得陽性克隆，命名為pshuttle-fiber-E4HR；

將經過單一酶切位點BamHI和SfuI所對應的內切酶雙酶切的篩選表達元件連入經過相同酶雙酶切的pshuttle-fiber?chimeric-E4HR載體，經堿性裂解法提取質粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆為腺病毒fiber-E4部位攜帶篩選基因的穿梭載體，命名為pshuttle-fiber?chimeric-E4/screening?gene；

(7)構建引入單一酶切位點的Ad5D24條件復制型腺病毒載體：

將pshuttle-fiber?chimeric-E4/screening?gene與pHBD24BM分別通過PacI與SwaI酶切線性化后，按摩爾比6∶1配制共轉化BJ5183感受態細胞，提取質粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆為引入單一酶切位點的Ad5D24條件復制型腺病毒載體，命名為pHBD24-fiber?chimeric-BS；

(8)構建攜帶外源基因的穿梭載體：

通過聚合酶鏈式反應方法擴增miniCMV-SV40表達元件，將產物與pGEMT-T?easy載體連接，通過酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/miniCMV-SV40；

同樣擴增PGK-SV40表達元件，將產物與pGEMT-T?easy載體連接，通過酶切及測序鑒定陽性克隆，所獲得陽性克隆命名為pGEMT/PGK-SV40；

將miniCMV-SV40片段與PGK-SV40片段分別從pGEMT/miniCMV-SV40和pGEMT/PGK-SV40上經相應酶切位點雙酶切下來，與經同樣酶切的pUCKanEHL進行連接，連接產物采用同樣的方法轉化，提取質粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pshuttle-BS-PGK-miniCMV；然后分別在miniCMV-SV40表達框中連入報告基因以及在PGK-SV40表達框中連入治療基因，提取質粒DNA，酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pshuttle-BS-治療基因/報告基因；

(9)攜帶外源基因的D24纖維蛋白修飾的條件復制型腺病毒載體的構建及病毒制備：

將構建好的pshuttle-BS-治療基因/報告基因與pHBD24-fiber?chimeric-BS經BamHI和SfuI酶切處理后連接，連接產物轉化、培養、篩選，經搖菌、提取質粒DNA、酶切及測序鑒定獲得陽性克隆為攜帶外源基因的D24纖維蛋白修飾的條件復制型腺病毒，命名為pHBD24-fiber?chimeric-治療基因/報告基因；

將pHBD24-fiber?chimeric-治療基因/報告基因載體經PacI線性化后轉染HEK293細胞，7-10天后獲得病毒原液，經過擴增，通過CsCl梯度離心純化后獲得攜帶外源基因的D24纖維蛋白修飾的條件復制型腺病毒載體，命名為HBD24-fiber?chimeric-治療基因/報告基因。

7.權利要求1所述的攜帶外源治療基因的D24纖維蛋白修飾的條件復制型腺病毒載體用于制備治療腫瘤藥物中的應用。