[發明專利]一種丙酮酸磷酸雙激酶重組表達菌株的構建方法及其應用

無效

• 申請號: 201210014850.8
• 申請日: 2012-01-18
• 公開（公告）號: CN102653727A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發明（設計）人: 王周平;夏雨;弓紫豐
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/54;C12N15/70;C12N9/12;C12R1/19
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【技術領域】

本發明涉及微生物分子生物學和基因工程技術領域，涉及微生物蛋白質編碼基因的克隆、表達載體的構建、重組表達菌株的構建、丙酮酸磷酸雙激酶的表達、純化及其應用。?

【背景技術】

丙酮酸磷酸雙激酶(Pyruvate?Phosphate?Dikinase；EC?2.7.9.1)能可逆催化磷酸烯丙式丙酮酸、單磷酸腺苷(Adenosine?Monophosphate；AMP)和焦磷酸鹽(Pyrophosphate；PPi)生成三磷酸腺苷(Adenosine?Triphosphate，ATP)、無機磷酸鹽(Orthophosphate)和丙酮酸。因此，該酶在ATP-熒光素-熒光素酶生物發光體系中能夠持續催化AMP生成ATP，對于體系形成穩態生物發光信號、簡化檢測過程中發光信號的測定具有積極意義。?

在實際應用中，該酶可用于ATP發光法快速檢測食品中的細菌數量。鄒秉杰等對熱玫瑰小雙孢菌來源的丙酮酸磷酸雙激酶進行了基因克隆、表達等研究，并將所得到的酶與熒光素酶偶聯，應用于ATP-AMP的催化循環反應(鄒秉杰，陳穎，馬寅姣，周國華.重組丙酮酸磷酸雙激酶與熒光素酶偶聯催化ATP-AMP循環反應[J].中國生物化學與分子生物學報，2008，24(11)：1081～1084.)。?

本發明采用天藍色鏈酶菌(Streptomyces?coelicolor)A3(2)株作為出發菌?株，對該菌株染色體DNA所編碼的丙酮酸磷酸雙激酶基因進行了克隆，構建了重組表達載體和重組表達菌株，并對重組表達菌株進行了誘導表達，在ATP-熒光素-熒光素酶生物發光體系中對該酶的活性進行了檢驗，結果提示天藍色鏈酶菌A3(2)株來源的丙酮酸磷酸雙激酶具有很高的酶活力，在微生物的生物發光法檢測中有很重要的應用價值。?

【發明內容】

[要解決的技術問題]?

本發明的目的是構建一種適合于在大腸桿菌中表達天藍色鏈酶菌A3(2)株來源的丙酮酸磷酸雙激酶的重組表達菌株，并提供該重組表達菌株誘導表達丙酮酸磷酸雙激酶的方法、丙酮酸磷酸雙激酶的的純化方法以及該酶的應用舉例。因而本發明要解決的技術問題就是：構建丙酮酸磷酸雙激酶表達載體和重組表達菌株所需的材料和方法，以及丙酮酸磷酸雙激酶的誘導表達和純化所需的材料和方法，以及進行ATP轉化的實際應用所需的材料和方法。?

[技術方案]?

本發明采用來源于天藍色鏈霉菌的丙酮酸磷酸雙激酶，構建一種適合該酶進行誘導表達的表達載體，構建適合該酶進行誘導表達的重組表達菌株，并采用上述構建的重組表達菌株進行丙酮酸磷酸雙激酶的誘導表達，然后對該丙酮酸磷酸雙激酶進行純化和酶活性檢測。?

本發明采用的宿主菌株為大腸桿菌BL21(DE3)，以市售的商品化大腸桿菌表達載體pET28a(+)作為本發明中誘導表達載體構建的基本骨架，以天藍?色鏈霉菌A(3)2基因組DNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction；簡稱PCR)擴增出丙酮酸磷酸雙激酶的編碼基因ppdk、構建重組表達載體pET28a-ppdk，并將該重組載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組表達菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk。?

重組表達菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk在含有50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(LB)液體培養基中進行培養，隨后采用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進行丙酮酸磷酸雙激酶的誘導表達，收獲誘導表達后的發酵菌體，進行超聲波破碎處理，對細胞破碎液進行離心并收獲含有丙酮酸磷酸雙激酶的上清液，表達結果通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來顯示和分析。采用親和層析方法對該酶進行純化處理，純化得到的樣品通過SDS-PAGE來顯示和分析。采用ATP-熒光素-熒光素酶生物發光體系對純化得到的丙酮酸磷酸雙激酶進行酶活力檢測和評估。?

[具體實施方式]?

(1)丙酮酸磷酸雙激酶編碼基因的克隆：首先以天藍色鏈霉菌A3(2)株基因組DNA為模板，采用引物P1和P2(見表1)進行PCR擴增得到ppdk基因片段，對該片段進行DNA序列測定以驗證其正確性。測序正確后用于下一步實驗。?