[發明專利]轉ALDH1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法

無效

• 申請號: 201210014242.7
• 申請日: 2012-01-17
• 公開（公告）號: CN102643838A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 唐克軒;陳韻斐;沈乾;王濤;吳韶龑;王國豐
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/82;C12Q1/68;A01H4/00;A01H5/00;G01N30/89
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

1.一種轉ALDH1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，該方法包括如下步驟：

(1)采用基因克隆方法獲得青蒿關鍵酶基因ALDH1；

(2)把所述ALDH1基因連結于表達調控序列，構建含ALDH1基因的植物表達載體；

(3)將所述含ALDH1基因的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得含所述ALDH1基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株；

(4)利用所述含ALDH1基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株轉化青蒿，獲得經PCR檢測的整合外源目的基因ALDH1的轉基因青蒿植株；

(5)對所述轉基因青蒿中青蒿素含量進行HPLC-ELSD測定，篩選獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。

2.根據權利要求1所述的轉ALDH1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(1)中，所述基因克隆方法包括以下步驟：提取青蒿基因組總RNA，將所獲的青蒿基因組總RNA通過反轉錄酶XL反轉錄獲得第一鏈cDNA，根據SEQ?ID?NO.1所示的DNA序列，設計擴增出完整編碼框的上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQ?ID?NO.2所示的DNA序列，所述下游引物為SEQ?ID?NO.3所示的DNA序列，并在所述上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點以便構建表達載體，以所述的第一鏈cDNA為模板，經PCR擴增后進行測序。

3.根據權利要求1所述的轉ALDH1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(2)中，所述構建包括以下步驟：先構建中間載體pMDT18-aldh1，再用XmaI和SacI酶切中間載體pMDT18-aldh1和表達載體FSN，回收ALDH1基因片段和FSN載體大片段，連接轉化，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。

4.根據權利要求3所述的轉ALDH1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述構建中間載體pMDT18-aldh1的具體步驟為：通過高保真酶擴增ALDH1基因前后分別引入XmaI和SacI酶切位點的基因全長，通過連接酶連接到pMDT18載體上。

5.根據權利要求1所述的轉ALDH1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(4)中，所述轉化包括以下步驟：外植體的預培養；農桿菌與所述外植體的共培養；抗性再生植株的篩選。

6.根據權利要求5所述的轉ALDH1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述預培養包括以下步驟：青蒿種子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，無菌水沖洗3-4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS固體培養基中，25℃光照培養，即可獲得青蒿無菌苗，待苗長至5cm左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉化。

7.根據權利要求5所述的轉ALDH1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述共培養包括以下步驟：將所述葉片外植體轉到共培養培養基中，滴加含活化好的所述含ALDH1基因植物雙元表達載體的根癌農桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28℃暗培養3天，以滴加在不帶有目的基因的根癌農桿菌的1/2MS液體培養基懸液的葉片外植體為對照。

8.根據權利要求5所述的轉ALDH1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述篩選包括以下步驟：將所述共培養3天的青蒿外植體轉入到發芽篩選培養基上于25℃光照培養，每兩周繼代培養一次，經過2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽，將所述生長良好的抗性叢生芽剪下轉入生根培養基上培養至生根，即可獲得Kan抗性再生青蒿植株。

9.根據權利要求1所述的轉ALDH1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(4)中，所述PCR檢測包括以下步驟：設計合成ALDH1基因的引物；進行DNA擴增；紫外線下觀察，若目的條帶為陽性，則該株系即為所述轉基因青蒿植株。

10.根據權利要求1所述的轉ALDH1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(5)中，所述HPLC-ELSD測定包括以下條件：所用色譜柱為C-18反相硅膠柱，流動相選用體積比為70∶30的甲醇∶水，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進樣量20μL，蒸發光散射檢測器漂移管溫度40℃，放大系數為7，載氣壓力5bar。