[發明專利]一種用短暫厭氧發酵調節重組大腸桿菌代謝的方法

有效

• 申請號: 201210013562.0
• 申請日: 2012-01-17
• 公開（公告）號: CN102747114A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 林建平;朱力;楊俊;傅維琦;岑沛霖
• 申請（專利權）人: 浙江大學;蘇州益安生物科技有限公司
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 杜軍

1.一種用短暫厭氧發酵調節重組大腸桿菌代謝的方法，其特征在于如下步驟：

步驟(1).用接種針從保藏編號為CGMCC?No.1939的工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA的甘油管中蘸取菌液后，在含有30???????????????????????????????????????????????50μg/ml卡那霉素和3050μg/ml氯霉素的LB培養基平板上劃線，并將劃線后的LB培養基平板放置于37℃下過夜培養；

步驟(2).?將LB培養基平板上的單克隆接種于含3050ml?LB培養基的250ml搖瓶中，并放置在轉速為200220rpm，溫度為37℃的搖床中過夜培養，得到一級種子；

步驟(3).?取15ml一級種子接種于含50100ml?LB培養基的500ml的搖瓶中，并放置在轉速為200220rpm，溫度為37℃的搖床中培養34h，得到二級種子；

步驟(4).?將100300ml二級種子接種于含79?L發酵培養基的15?L發酵罐中進行發酵培養，發酵罐的攪拌轉速為300500rpm,?空氣流量為510?L/min，起始培養溫度為37℃；23h后培養溫度降至2630℃，并用0.020.2mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導；

所述的步驟(4)中的發酵培養基是由質量體積比分別為0.52%蛋白胨、0.251%酵母粉、0.31%琥珀酸、0.20.4%甘氨酸和0.10.5%葡萄糖組成，其pH值為6.06.3；發酵培養基最開始用1020%體積分數的稀硫酸，將pH控制在5.86.0；

步驟(5).?當菌體生長至56小時后，將發酵罐的攪拌轉速調為0，發酵液中溶氧值隨之變為0，維持3075min?的厭氧發酵后恢復發酵罐的攪拌轉速；

所述的發酵液，在二級種子接種48h后通過反饋流加補料培養基，將發酵液的pH調為6.16.3；

所述的補料培養基體積為8001100ml，且含有7090?g琥珀酸和5070?g甘氨酸；?

步驟(6).?當菌體密度OD₆₀₀達到310?時，分批或者連續補加5-氨基乙酰丙酸脫水酶抑制劑；

所述的5-氨基乙酰丙酸脫水酶的抑制劑為35g/L?D-葡萄糖；

所述的步驟(1)中的保藏編號為CGMCC?No.1939工程菌，分類命名：中文名為大腸埃希氏菌，拉丁文學名為Escherichia?coli?Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA。