[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210013506.7
• 申請(qǐng)日: 2012-01-17
• 公開（公告）號(hào): CN102604987A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐克軒;王玥月;陳韻斐;吳韶龑;王濤;沈乾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 上海漢聲知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國(guó)中

1.一種轉(zhuǎn)DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，該方法包括如下步驟：

(1)采用基因克隆方法獲得青蒿關(guān)鍵酶基因DXR；

(2)把所述DXR基因連結(jié)于表達(dá)調(diào)控序列，構(gòu)建含DXR基因的植物表達(dá)載體；

(3)將所述含DXR基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得含所述DXR基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；

(4)利用所述含DXR基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的整合DXR基因的轉(zhuǎn)基因青蒿植株；

(5)對(duì)所述轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量進(jìn)行HPLC-ELSD測(cè)定，篩選獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(1)中，所述基因克隆方法包括以下步驟：提取青蒿基因組總RNA，將所獲的青蒿基因組總RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶XL反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，根據(jù)SEQ?ID?NO：1所示的DNA序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼框的上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQ?ID?NO：2所示的DNA序列，所述下游引物為SEQ?ID?NO：3所示的DNA序列，并在所述上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)以便構(gòu)建表達(dá)載體，以所述的第一鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(2)中，所述構(gòu)建含DXR基因的植物表達(dá)載體包括以下步驟：先構(gòu)建中間載體pMDT18-dxr，再用XmaI和SacI酶切中間載體pMDT18-dxr和表達(dá)載體FSN，回收DXR基因片段和FSN載體大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測(cè)和酶切驗(yàn)證。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述構(gòu)建中間載體pMDT18-dxr包括以下步驟：通過(guò)高保真酶擴(kuò)增DXR基因前后分別引入XmaI和SacI酶切位點(diǎn)的基因全長(zhǎng)，通過(guò)連接酶連接到pMDT18載體上。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(4)中，所述轉(zhuǎn)化包括以下步驟：外植體的預(yù)培養(yǎng)；農(nóng)桿菌與所述外植體的共培養(yǎng)；抗性再生植株的篩選。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述預(yù)培養(yǎng)包括以下步驟：青蒿種子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，無(wú)菌水沖洗3-4次，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，接種于無(wú)激素的MS固體培養(yǎng)基中，25℃光照培養(yǎng)，即可獲得青蒿無(wú)菌苗，待苗長(zhǎng)至5cm左右后，剪取無(wú)菌苗葉片外植體用于轉(zhuǎn)化。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述共培養(yǎng)包括以下步驟：將所述葉片外植體轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，滴加含活化好的所述含DXR基因植物雙元表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液，使所述外植體與菌液充分接觸，28℃暗培養(yǎng)3天，以滴加在不帶有目的基因的根癌農(nóng)桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對(duì)照。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，所述篩選包括以下步驟：將所述共培養(yǎng)3天的青蒿外植體轉(zhuǎn)入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基上于25℃光照培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代培養(yǎng)一次，經(jīng)過(guò)2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽，將所述生長(zhǎng)良好的抗性叢生芽剪下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)至生根，即可獲得Kan抗性再生青蒿植株。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(4)中，所述PCR檢測(cè)包括以下步驟：設(shè)計(jì)合成DXR基因的引物；進(jìn)行DNA擴(kuò)增；紫外線下觀察，若目的條帶為陽(yáng)性，則該株系即為所述轉(zhuǎn)基因青蒿植株。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)DXR基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟(5)中，所述HPLC-ELSD測(cè)定包括以下條件：所用色譜柱為C-18反相硅膠柱，流動(dòng)相選用體積比為70∶30的甲醇∶水，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量20μL，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度40℃，放大系數(shù)為7，載氣壓力5bar。