[發明專利]使用核酸擴增法檢測人乳頭瘤病毒的方法和核酸鏈固定化載體

有效

• 申請號: 201210013254.8
• 申請日: 2006-12-08
• 公開（公告）號: CN102517401A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 橋本幸二;伊藤桂子;中村奈緒子;堀內秀紀;橋本美智惠;佐藤宰
• 申請（專利權）人: 株式會社東芝;積水醫療株式會社
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 胡志君;黃革生

本申請是中國專利申請200680046297.9的分案申請，原申請的申請日是2006年12月8日，發明名稱是“使用核酸擴增法檢測人乳頭瘤病毒的方法和核酸鏈固定化載體”。

技術領域

本發明涉及用于檢測人乳頭瘤病毒和鑒定其基因型的核酸引物序列、試劑盒、和核酸鏈固定化載體，并涉及通過使用核酸擴增法檢測人乳頭瘤病毒的方法。

背景技術

在1980年代，據報道人乳頭瘤病毒(HPV)感染是引起子宮頸癌的原因，并且特別引人注意的是癌惡性度和HPV基因型之間的關系。也認為HPV是引起非子宮頸癌的其它癌的原因，其中所述其它癌如生殖器癌和口腔粘膜癌，因此需要快速且正確地檢測HPV的方法。至今為止，已知通過使用DNA/RNA識別抗體檢測惡性或良性基因型的方法、以及通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增包含對于基因型而言特征性序列的區域并最后通過使用基因型特異的探針鑒定基因型的方法。但是不能鑒定基因型的前一方法不能應用至當前開發的用于疫苗施用的檢測。另外，使用PCR法的后一方法也有缺點，如核酸提取等預處理的繁鎖操作、需要復雜的溫度調節設備如熱循環儀、和較長的兩小時或更長的反應期間。此外，PCR法有這樣一種可能性，如果偶然合成了不正確的互補鏈，該產物可用作擴增中的模板，結果導致不正確的判斷。實際上，難于控制在引物末端僅有一個核苷酸差異的特異性擴增。

對于通過使用DNA芯片的檢測，通過PCR法擴增的基因產物通常為雙鏈。因此，出現了互補鏈成為探針的競爭物的問題，降低了在雜交反應中使用探針的雜交效率和檢測靈敏性。因此，例如，采用了分解或分離互補鏈的方法，使得靶基因產物成為單鏈。但是，這些方法仍有問題，如由于使用酶和磁珠產生的較高的成本和復雜的操作，需要替代這些常規方法的新方法。

發明公開

本發明的一個目的是：當應用允許簡便且快速地檢測核酸的LAMP法的原理時，提供用于檢測存在于LAMP擴增產物中的HPV核苷酸序列的核酸引物，以及使用所述核酸引物的HPV檢測方法。

本發明應用了不同于PCR法的方法即LAMP法來鑒定HPV基因型。因此，可能易于鑒定基因型。但是，LAMP產物具有復雜的高級結構，在雜交中使用結合有探針的支持物引起物理阻礙，這接下來導致降低雜交效率(參見如JP-A?2005-095043(KOKAI))。因此，在本發明中，如此設計引物，使得衍生自人乳頭瘤病毒的靶序列位于LAMP產物的單鏈環區，這與現有技術不同。

根據本發明的一個方面，提供了用于檢測人乳頭瘤病毒和鑒定其基因型的LAMP擴增用核酸引物，所述核酸引物選自以下的(a)-(f)：(a)核酸引物，其在同一鏈上含有選自表1中所示第一序列組的序列的互補序列和選自表2中所示第二序列組的序列；(b)核酸引物，其在同一鏈上含有選自第一序列組的序列的互補序列和選自表3中所示第三序列組的序列；(c)核酸引物，其在同一鏈上含有選自第二序列組的序列的互補序列和選自第三序列組的序列；(d)核酸引物，其含有通過插入、缺失、或替代一個或多個堿基而不同于核酸引物(a)、(b)和(c)之一的所選序列的序列，并且能夠與具有核酸引物(a)、(b)和(c)之一的所選序列的互補序列的核酸鏈雜交；(e)核酸引物，其含有選自表4中所示第四序列組的序列或其互補序列；和(f)核酸引物，其含有通過插入、缺失、或替代一個或多個堿基而不同于核酸引物(e)之一的所選序列的序列，并且能夠與具有核酸引物(e)之一的所選序列的互補序列的核酸鏈雜交。

根據本發明的另一方面，提供了檢測人乳頭瘤病毒并鑒定其基因型的方法，包括在LAMP反應中通過使用多條引物擴增樣本中的核酸鏈的步驟和在擴增反應后檢測擴增產物的存在并鑒定它們的基因型的步驟，其中所述多條引物包括選自上述核酸引物中的至少一條引物。