[發明專利]一種胰蛋白酶抑制劑及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201210012186.3
• 申請日: 2012-01-15
• 公開（公告）號: CN102558360A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 李卓玉;李宗偉;趙超;李漢卿;史通麟
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/56;A61K47/48;A61P35/00;C12R1/19
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司) 14105
• 代理人: 楊耀田

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種胰蛋白酶抑制劑及其制備方法和該抑制劑在制備抗癌藥物中的應用。

背景技術

GRP78(glucose-regulated?protein，GRP78)在正常細胞中與ATF-6、IRE1(inosito?lr?equiring?enzyme?1)和PERK(double?st?randed?RNA?activated?protein?kinase?like?ER?kinase)結合形成無活性狀態復合體。當非折疊蛋白增多，GRP78即與該復合體分離激活，將信號傳遞到細胞核中從而啟動非折疊蛋白反應促進蛋白質的正確折疊，防止非折疊蛋白的累積，靶向降解錯誤折疊蛋白。有研究表明，GRP78在腫瘤細胞中通常發生過表達，并且可以特異的存在于腫瘤細胞的表面，而正常細胞膜表面不含GRP78。因此，腫瘤細胞表面的GRP78可以作為抗腫瘤的特異性的分子靶點。有研究通過噬菌體展示技術發現，多肽片段可以與腫瘤細胞表面的GRP78特異結合并通過GRP78進入細胞內部，可以作為抗腫瘤靶向藥物的導肽。

人類蛋白酶體CP的沉降系數為20S，分子量約700～750kD。它由α環和β環組成，每個環各有7個相同的亞單位，不同的β亞單位的催化活性盡管不同，但能互相協調使蛋白酶體具有多種蛋白酶活性，如類糜蛋白酶活性(chymotrypsin-like，ChTL)、類胰蛋白酶活性(trypsin-like，TL)、肽-谷氨酰肽水解酶活性(post-glutamyl-peptide?hydrolyzing，PGPH)、支鏈氨基酸肽酶活性、中性氨基酸切割活性。由于蛋白酶體活性狀態對細胞執行不同的功能是非常重要的，因此蛋白酶體將成為影響細胞功能的重要藥物靶標，而其抑制劑有可能成為抗腫瘤的先導藥物。泛素-蛋白酶體系統是細胞內調節蛋白平衡的蛋白降解系統，在細胞的生命活動中發揮了關鍵作用。蛋白酶體含有胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和肽-谷氨酰肽水解酶活性，其活性的抑制可以誘導細胞凋亡。硼替佐米(Bortezomib)是第一種用作化學治療藥物的蛋白酶體抑制劑，由千年制藥公司(Millennium?Pharmaceuticals)開發，市場名稱為Velcade。硼替佐米主要被用于多發性骨髓瘤的治療。值得一提的是，多發性骨髓瘤會導致血清中蛋白酶體水平的提高，而成功的化療可以將蛋白酶體的水平恢復到正常范圍。硼替佐米在治療B細胞相關癌癥的臨床前和早期臨床研究已經開始，但是，Bortezomib在腫瘤的治療中表現出了許多副作用，對癌細胞的殺傷專一性不夠強，因此，研發對癌細胞具特異殺傷的藥物迫在眉睫，對腫瘤的預防具有重要的和深遠的意義。

有文獻報道，已經發現一肽段可與腫瘤細胞表面的GRP78特異結合，其序列為：WIFPWIQL。本實驗室通過基因工程手段將綠豆胰蛋白酶抑制劑賴氨酸活性區域與該GRP78結合肽段(glucose-regulated?protein?binding?peptide)，通過設計一個相同的限制性內切酶位點，構建成融合蛋白，制備能夠通過與腫瘤細胞表面GRP78結合，且靶向抑制腫瘤細胞蛋白酶體的靶向抗癌藥物(GBP-K33)。

發明內容

本發明的目的是提供一種胰蛋白酶抑制劑及其制備方法和該抑制劑在制備抗癌藥物中的應用。

本發明提供的一種胰蛋白酶抑制劑，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1，該抑制劑對癌細胞增殖有抑制作用，對癌細胞的凋亡有促進作用，對正常細胞卻沒有任何毒副作用。

編碼所述胰蛋白酶抑制劑的基因，其核苷酸序列為：SEQ?ID?NO：2。該核苷酸序列由123個核苷酸組成。

一種載體，含有上述所述的核苷酸序列。它是將編碼GBP-K33的核苷酸片段克隆至原核表達載體后獲得的重組子pGEX-4T-1-GBP-K33。所述的載體，是一種質粒。

一種工程菌，含有上述所述的載體。是將重組子pGEX-4T-1-GBP-K33轉化至一種菌中，例如大腸桿菌BL21中，構建成工程菌。

胰蛋白酶抑制劑的制備方法，包括如下步驟：化學合成基因GBP片段和K33，將這兩段序列連接到pGEX-4T-1載體上，獲得重組子pGEX-4T-1-GBP-K33，將該重組子轉化到大腸桿菌BL21，構建大腸桿菌工程菌pGEX-4T-1-GBP-K33/BL21，將該工程菌接種在含氨芐青霉素的LB培養基中，37℃振蕩培養至A?600nm為0.4-0.6，加入IPTG使終濃度為0.5mmol/L，誘導表達3-5小時，收集菌體，將上清液經親和層析純化獲得目的蛋白。