[發明專利]用兩種培養基序貫培養人臍帶血間充質干細胞的方法

有效

• 申請號: 201210011823.5
• 申請日: 2012-01-16
• 公開（公告）號: CN102559590A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 余麗梅
• 申請（專利權）人: 遵義醫學院附屬醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京聯創佳為專利事務所(普通合伙) 11362
• 代理人: 郭防;王娟

技術領域

本發明涉及一種用兩種培養基序貫培養人臍帶血間充質干細胞（human?umbilical?cord?blood?mesenchymal?stem?cells，hUCB-MSCs）的方法，屬于細胞工程及生物醫藥技術領域。?

背景技術

人臍血(human?umbilical?cord?blood，hUCB)是胎兒出生時臍帶內及胎盤內近胎兒側血管內的血液，含有豐富的干/祖細胞，研究較多的主要為造血干細胞和間充質干細胞(mesenchymal?stem?cell，MSCs)。人臍帶血間充質干細胞(hUCB-MSCs）是一種成纖維細胞樣，具有無限增殖和多向分化潛能的干細胞，表達SH2、SH3、SH4、ASMA、MAB1470、CD13、CD29、CD44、CD166和CD73等細胞表面抗原，但不表達CD34、CD45、CD14等表面標志；與骨髓來源的MSCs具有相似生物學特性，但其培養成功率相對較低，據統計只有25-30%的臍血樣本培養后出現MSCs，限制了其研究及應用價值的進一步發掘。不同的培養基、細胞因子、擴增體系及純化方法，可直接影響hUCB-MSCs培養的成功與否、擴增的數量及其生物學特性的保持。但又因其具有來源豐富，易收集，不涉及明顯的倫理及法律爭議，被病毒、細菌污染機率小，且免疫原性低、增殖分化能力強等優點，已在神經元退行性疾病、組織損傷等疾病的治療中顯示出良好的臨床應用前景，故而不斷優化其培養體系一直備受關注。

hUCB-MSCs除可在適宜條件下分化為成骨細胞、成肌細胞、脂肪細胞、神經元細胞、心肌細胞、肝樣細胞及胰島細胞之外，還具有免疫調節作用和分泌功能；與造血干細胞一起移植，還可促進機體造血功能的恢復及長期造血功能的重建。但培養過程中，hUCB-MSCs數量少、獲率低、周期長是制約其應用的瓶頸。臍帶血中MSCs的比例較骨髓低得多（0.05-2.8/1×10⁶hUCB單個核細胞，2-5/1×10⁶骨髓單個核細胞）；加之hUCB-MSCs缺乏特異性標志，其分離方法相對粗糙，難以去除混雜的破骨樣細胞，大部分臍血標本中破骨樣細胞占優勢，MSCs夾雜其間，很難生長達到融合，無法傳代。目前常用的分離、純化方法主要是采用Ficoll、Percoll等密度梯度離心法和差速貼壁法進行單個核細胞的分離及hUCB-MSCs的純化。

以往的hUCB-MSCs培養通常使用單一的DMEM/F12、DMEM/MEM、DMEM/Ham、α-MEM和IMDM等，加以自體血清、臍帶血血清，human?platelet?lysate替代FBS，或添加氫化可的松、粒單細胞集落刺激因子、胰島素等；也可通過調整pH偏酸性的Mesencult^TM間充質專用培養基，結合差速貼壁，傳代培養出了高純度的hUCB-MSCs。但這些培養方法突出的問題在于hUCB-MSCs培養成功率較低，尤其是單一的DMEM/F12、DMEM/MEM等培養基傳代培養3-5代后還出現明顯的hUCB-MSCs生物學形態特征和功能改變，不適于細胞需求量較大的研究與應用。另外，許多市售專用培養基除存在經濟成本較高外，在原代培養過程中破骨樣細胞的生長常常比較旺盛，明顯不利于差速貼壁、傳代培養后純化hUCB-MSCs，甚而極大地降低了hUCB-MSCs的培養成功率。?

發明內容

本發明的目的在于：提供一種用兩種培養基序貫培養人臍帶血間充質干細胞的方法。本發明選用不適于破骨樣細胞生長的pH值偏酸的DMEM/F12培養基，在提高hUCB-MSCs集落形成和原代培養hUCB-MSCs成功率的同時，又發揮了后續使用Oricell人臍帶間充質干細胞培養基能多次傳代、較大量擴增hUCB-MSCs，并保持hUCB-MSCs良好生物學特性的優點，還大大降低了使用單一專用培養基的經濟成本。

本發明的技術方案：用兩種培養基序貫培養人臍帶血間充質干細胞的方法：采用淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離人臍帶血單個核細胞，然后用pH值偏酸（pH=6.5-6.8）的含10%FBS的DMEM/F12培養基原代培養人臍帶血間充質干細胞，P0代細胞消化傳代時，繼續用含10%FBS的DMEM/F12培養基傳代培養至P2代，同時通過換液和酶消化結合差速貼壁法進行P1-P2代細胞的純化；從P3代細胞開始，改用Oricell人臍帶間充質干細胞培養基傳代培養至P8代。