[發明專利]血清5型豬胸膜肺炎放線桿菌Apx I C/Apx II C雙基因缺失疫苗候選株

有效

• 申請號: 201210011702.0
• 申請日: 2012-01-16
• 公開（公告）號: CN102796679A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 曹三杰;文心田;劉瓊;黃小波;龔雨恒;文翼平;趙勤;馬曉平;張宇;周家強
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/68;C12R1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一株無藥物抗性標記的血清5型豬胸膜肺炎放線桿菌Apx?I?C/Apx?II?C雙基因缺失疫苗候選株，屬于動物細菌基因工程及獸醫生物制品領域。?

背景技術

豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(APP)引起的一種豬的高度傳染性和致死性呼吸道疾病。廣泛存在于全世界所有的養豬國家，尤以歐美各國流行嚴重，給養豬業造成了巨大的經濟損失，嚴重地阻礙了世界養豬業的健康發展。由于胸膜肺炎放線桿菌血清型眾多，且各個國家及地區流行的優勢血清型各不相同，給該病的防制帶來了極大的困難。目前該病在我國發病率仍逐年增長，有的豬場陽性率已達到70％以上，已經成為集約化豬場的主要傳染病之一，嚴重危害到我國的養豬業。?

胸膜肺炎放線桿菌于1957年由Pattison等首次報道，最早分離于1961年，隨后在1963年和1964年相繼報道了該病原菌的分離，1990年我國的楊旭夫首次正式確認了國內大型集約化養豬場存在PCP，同時分離出致病菌株并確定了血清型。豬胸膜肺炎放線桿菌屬于巴氏桿菌科，放線桿菌屬，為革蘭氏陰性多形態小球桿菌，兼性厭氧，有莢膜和菌毛，不形成芽抱，能產生4種RTX毒素。新鮮病料中的APP呈兩極染色。多數菌株在綿羊鮮血平板上呈β溶血，它在金黃色葡萄球菌劃線兩側，產生一種寬的加重溶血區(cAMP)和“衛星”現象。本菌需要的營養條件必須豐富，否則即使加入NAD也生長不出典型菌落，但經多次傳代后在LB培養基上也能生長。APP專性寄生于豬的呼吸道，但也有從羔羊體內分離到的報道。?

APP是一種多毒力因子病原，如動物機體的免疫狀況、病原的數量、病原的毒力因子及外界環境的影響等，其中病原的毒力因子在疾病的發生、發展過程中?起著舉足輕重的作用。多年來，毒力因子與致病力之間的關系亦是國內外學者最為關注的問題，Bosse等(2002)詳細地闡述APP感染的病理學及致病機理。APP的毒力因子主要包括溶血外毒素、莢膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、轉鐵結合蛋白、蛋白酶、脲酶等，其中溶血外毒素是引起豬發病最重要的毒力因子。?

溶血外毒素也稱為Apx毒素。APP產生的溶血外毒素(Apx)被認為是APP最重要的一個毒力因子。Devenish等(1990)研究發現Apx也是一種重要的免疫原，Apx刺激機體產生的抗體水平和保護力呈正相關。全部15個APP血清型中共分泌4種Apx毒素，分別為Apx?I、Apx?II、Apx?III和Apx?IV，四者都屬于細胞孔形成毒素。前3種Apx毒素既是APP致病的主要毒力因子，又是APP主要的保護性抗原。Jansen?R等(1995)發現不分泌或缺失Apx的APP菌株對小鼠和豬均不致病，缺失株補充了Apx的結構基因和分泌基因后可恢復原來的毒力，而且氣管灌注可以直接引起動物的臨診癥狀和肺部病變。感染耐過豬可以抵抗其他血清型的再次感染，許多能產生毒素的弱毒活苗都具有交叉保護力，均是由于Apx毒素能誘導機體產生抗毒素的抗體。?

Apx?I由Apx?I操縱子編碼，該操縱子包Apx?I?C、Apx?I?A、Apx?I?B、Apx?I?D?4個基因，A基因編碼無活性的前體結構蛋白，C基因編碼毒素激活蛋白，負責對毒素進行酰基化激活，B、D基因的翻譯后蛋白產物形成跨膜通道，負責毒素由細胞內到細胞外的分泌。Apx?I?C、Apx?I?A、Apx?I?B、Apx?I?D基因的核甘酸序列在各種血清型中有高度相似性。Apx?II由Apx?II操縱子所編碼，該操縱子僅包括結構基因Apx?II?A和激活基因Apx?I?C，而無分泌基因。Apx?III由Apx?III操縱子所編碼，與Apx?I一樣具有完整的操縱子。Apx?III雖然沒有溶血活性，但與Apx?I和Apx?II一樣，都具有協同溶血活性。Apx?IV毒素Apx?IV毒素是近幾年在研究豬胸膜肺炎放線桿菌分泌的毒素中發現的，它在整個致病過程中的作用尚不清楚，因為缺少Apx?I、Apx?II，Apx?III但仍能產生Apx?IV的菌株不能引起病變或發病。研究表明，所有血清型的APP在體內均可產生Apx?IV毒素。?