[發明專利]硫化物醌氧化還原酶基因載體構建及其轉基因工程乳酸菌菌株

無效

• 申請號: 201210011674.2
• 申請日: 2012-01-16
• 公開（公告）號: CN102559732A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 于建寧;王公金;徐小波;潘偉芹;于峰祥;李燕;陳哲
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66;C12N1/21;C12N9/02;C12R1/46
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.硫化物醌氧化還原酶基因載體pMG36e-SQR-Myc，其構建方法包括：?

1）?pMG36e-SQR-Myc載體構建

選用pcDNA3.1-SQR-Myc真核表達質粒為最初原材料，利用限制性內切酶KpnⅠ和?Xba?I將SQR目的基因連同Myc標記基因SQR-Myc從pcDNA3.1-SQR-Myc載體上酶切下來，回收SQR-Myc基因片段，采用T4連接酶將其連接于pMG36e載體相應的酶切位點，構建成pMG36e-SQR-Myc原核表達載體；利用KCM轉化法導入大腸桿菌DH5α中，在含有紅霉素的LB培養基上篩選、鑒定出陽性轉化子；?

2）?含SQR基因的重組質粒陽性鑒定

分別挑取陽性轉化子白色菌落進行?PCR法和雙酶切法鑒定：

接種至LB培養基中培養，堿裂解法少量提取質粒，經雙酶切鑒定目的基因SQR和標記基因Myc連接于pMG36e的相應位點；

以質粒為模板，根據SQR基因序列設計引物P1、P2，鑒定陽性重組質粒，引物P1?TCGTCACCAAGGACCCGATGTAT，P2??TCACGGCCTTCAGCTTGTCG，反應條件為?94℃，預變性5min，94℃變性10s，?51℃退火30s，72℃延伸80s，共30個循環，72℃延伸10min，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，含有SQR基因的條帶，大小為1179bp。

2.用權利要求1所述載體轉化獲得的轉基因工程乳酸菌菌株，是由以下步驟獲得的：

1）?乳酸乳球菌MG1363感受態的制備

接種MG1363于GM17培養基中，30?℃培養過夜，按體積比5%接種量接種于含體積比1%的甘氨酸的SGM17培養基至?OD值為0.2~0.8，培養結束后將細菌培養物冰浴10min，離心收集菌體，冰冷的甘油磷酸緩沖液洗滌菌體3次，最后采用菌液體積的1/100的電擊緩沖液重懸菌體；

2）電穿孔法轉化MG1363

質粒pMG36e-SQR-Myc與上述感受態MG1363混合，冰浴10min，電擊，電轉參數如下：電壓2000?V，電容25?μF，電阻400Ω，

?30℃?復蘇培養3?h后，將其涂布在含有10μg/?mL的紅霉素GM17平板上，培養2～3?d，獲得轉基因工程乳酸菌菌株菌落。

3.權利要求2所述轉基因工程乳酸菌菌株表達的硫化物醌氧化還原酶，是由以下步驟獲得的：取權利要求2所述轉基因工程乳酸菌菌株，接種于?5mL?液體GM17培養基中，過夜培養，收集菌體，用雙蒸水洗2次，加入終濃度10mg/mL溶菌酶100μl，37℃消化30min，加等量的上樣緩沖液，100?℃作用5?min，高速離心后用于SDS-PAGE電泳，結果顯示表達產物中含有目的蛋白的條帶,大小為53KD，即為獲得的所述轉基因工程乳酸菌菌株表達的硫化物醌氧化還原酶。