[發(fā)明專利]小麥人工染色體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210011561.2
• 申請日: 2012-01-13
• 公開（公告）號: CN102925477A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓方普;呂振玲;符書蘭;胡贊民;宋麗英;裴熙祥
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/84;A01H5/00;C12Q1/68;C12N15/29
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 張國梁

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及在小麥中獲得人工小染色體的方法。本發(fā)明通過將含有擬南芥端粒序列的植物載體轉(zhuǎn)化小麥，而在小麥中發(fā)生端粒介導(dǎo)的染色體的切割，進(jìn)而獲得小麥人工小染色體。本發(fā)明還涉及對所獲得的小麥中的小染色體進(jìn)行檢測的方法。本發(fā)明還涉及人工小染色體技術(shù)在小麥基因工程中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

植物基因工程技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)歷了近30年，作為現(xiàn)代生物技術(shù)的核心技術(shù)，其已經(jīng)在農(nóng)牧業(yè)，食品，環(huán)保等方面顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。植物基因工程技術(shù)主要是將外源基因構(gòu)建到可表達(dá)的重組載體中，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)或者通過粒子轟擊轉(zhuǎn)化到宿主基因組中表達(dá)，最終改變植物性狀[1-2]。然而，當(dāng)今的基因工程技術(shù)也存在著許多局限性。例如，多基因轉(zhuǎn)化，目前應(yīng)用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法實現(xiàn)多基因的共轉(zhuǎn)化難度較大，這極大地限制了對數(shù)量性狀基因及代謝復(fù)合物與多產(chǎn)物的合成所涉及的多個基因的同時轉(zhuǎn)化[3-4]；外源基因在整合到宿主基因組中時，往往整合進(jìn)內(nèi)源基因而導(dǎo)致內(nèi)源基因失去功能；同時轉(zhuǎn)化的隨機性使得轉(zhuǎn)入的外源基因很難進(jìn)行操控。隨著作物基因工程和人工染色體技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了人工微小染色體[5]技術(shù)，人工染色體可以作為外源基因表達(dá)的獨立平臺，由于不用整合到宿主基因組中，所以不會引起宿主基因的插入失活以及轉(zhuǎn)基因的位置效應(yīng)。而且通過位點特異重組系統(tǒng)，多個基因可以以有序的方式添加到小染色體上。因此，小染色體的出現(xiàn)提供了解決常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的問題的有效途徑。

端粒(tolemere)是染色體末端的DNA重復(fù)序列，是染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，端粒的功能除保證DNA完整復(fù)制外，還在維持染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(保護(hù)染色體不分解和染色體重排及末端不相互融合等)。許多多細(xì)胞真核生物的端粒序列都已被克隆[6-8]。Farr等將克隆的人類端粒序列導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞中驗證端粒功能，發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)入的端粒序列能夠在染色體上產(chǎn)生新的端粒[9-10]。目前科學(xué)家利用端粒介導(dǎo)截短法和從頭染色體誘導(dǎo)合成法成功構(gòu)建了人類人工染色體，然后通過同源重組等方法向人類人工染色體中插入各種用途的基因序列，現(xiàn)已經(jīng)用于基因治療和醫(yī)療蛋白的生產(chǎn)[11]。

植物的人工染色體較哺乳動物和人類細(xì)胞的研究而言起步較晚，無論是基于天然染色體改造的自上而下策略，還是將克隆的染色體功能元件人工組裝的自下而上策略在植物的研究中都只是出于起步階段。在植物中，利用自下而上策略第一個微小染色體的成功報道是在玉米，Carlson等[12]在體外將標(biāo)記基因篩選基因及著絲粒重復(fù)序列連接成環(huán)，重組載體不含端粒序列，但是可以在細(xì)胞中完成微小染色體的組裝，由于它不含有端粒結(jié)構(gòu)，能否作為一種穩(wěn)定的載體系統(tǒng)還有待研究。Ananiev等[13]將玉米的著絲粒序列、端粒序列及選擇標(biāo)記基因等在體外連接，通過粒子轟擊的方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，最終組裝成為微小染色體。Yu等[14，15]利用含有2.6kb的擬南芥端粒序列載體成功的將截短法應(yīng)用在B染色體和四倍體玉米中的A染色體，截短的染色體對玉米的生長發(fā)育沒有明顯影響。這是端粒介導(dǎo)的染色體截斷技術(shù)在植物中的首次報道，也為植物人工染色體的成功應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。Chee等[16]同樣的利用端粒介導(dǎo)的染色體截短法在擬南芥中成功的獲得截短的穩(wěn)定遺傳的小染色體，研究發(fā)現(xiàn)四倍體的Wa-1的轉(zhuǎn)化效率要高于二倍體的Col-0，這可能是由于多倍體的植株更能忍受截短染色體給基因組帶來的沖擊。小麥?zhǔn)橇扼w，也是重要的糧食作物，考慮到植物物種間的差異，采用端粒重復(fù)序列能否在小麥中構(gòu)建人工染色體尚不清楚。目前小麥人工染色體的研究尚未見報道。因此，本領(lǐng)域需要研究用于在小麥中創(chuàng)建穩(wěn)定遺傳的人工小染色體的方法以及該方法進(jìn)一步的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明通過將含有擬南芥端粒序列的植物載體轉(zhuǎn)化小麥，而在小麥中發(fā)生端粒介導(dǎo)的染色體的切割，進(jìn)而獲得小麥人工小染色體。本研究證明了2.6kb的擬南芥端粒序列重復(fù)對于小麥中端粒介導(dǎo)的染色體的切割是高效的，可以通過這一技術(shù)獲得小麥人工體以及帶有小染色體的轉(zhuǎn)基因小麥工程株，利于對其進(jìn)行進(jìn)一步轉(zhuǎn)多基因改造。

因此，本發(fā)明一方面提供在小麥中創(chuàng)建人工小染色體的方法，所述方法包括：用含有擬南芥端粒重復(fù)序列的載體轉(zhuǎn)化小麥，所述擬南芥端粒重復(fù)序列在小麥中導(dǎo)致端粒介導(dǎo)的染色體的切割。

本發(fā)明另一方面提供對創(chuàng)建的人工小染色體進(jìn)行檢測的方法，其中利用熒光原位雜交技術(shù)和/或雙色熒光原位雜交技術(shù)檢測轉(zhuǎn)化植株的染色體切割。

本發(fā)明還一方面提供產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小麥的方法，所述方法包括：用含有擬南芥端粒重復(fù)序列的載體轉(zhuǎn)化小麥，所述擬南芥端粒重復(fù)序列在小麥中導(dǎo)致端粒介導(dǎo)的染色體的切割。