[發明專利]一種柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因及其表達方法和應用

無效

• 申請號: 201210010853.4
• 申請日: 2012-03-02
• 公開（公告）號: CN102676554A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 周變華;王宏偉;趙振升;王國永;孔濤;劉梅;郝雪琴
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/70;C12N9/16;A61K48/00;A61P33/02
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因，其特征在于：具有編碼SEQ?ID?NO.1的氨基酸序列。

2.根據權利要求1所述的柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因，其特征在于：所述的基因全長2562bp，含有完整的1647bp?ORF，編碼549個氨基酸，理論分子量為60822.4Da，分子式為C₂₇₀₅H₄₂₃₅N₇₃₉O₈₀₃S₂₇，等電點為5.89，帶負電荷的氨基酸總數(Asp+Glu)為71個，帶正電荷的氨基酸總數(Arg+Lys)為62個，總體偏酸性。抗原位點分析發現有19個可能的抗原位點。

3.一種柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因的表達方法，其特征在于：包括以下步驟：以E.tenella為實驗蟲株，建立了藥物抗球蟲作用模型，以E.tenella第二代裂殖子為研究對象，構建了地克珠利作用E.tenella第二代裂殖子差異表達cDNA消減文庫，借助cDNA微陣列技術篩選出一種地克珠利抗球蟲作用的關鍵分子，經BlastP比對分析表明為E.tenella絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(EtPP)EST序列。

4.根據權利要求1所述的柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因的表達方法，其特征在于：所述的表達方法具體包括以下步驟：

(一)E.tenella第二代裂殖子的制備

(1)試驗模型的建立

優質黃羽蛋公雛，實驗動物飼養至12日齡時，平均分為兩組，實驗14日齡，兩種均接種球蟲，分為感染對照組(接種球蟲，0mg/kg地克珠利飼料)和藥物處理組(接種球蟲，1mg/kg地克珠利飼料，從實驗96h到實驗120h)，建立地克珠利抗球蟲試驗動物模型；

(2)E.tenella第二代裂殖子的制備

在感染后120h撲殺試驗雞，剪開盲腸壁，去除盲腸內容物，用含雙抗冰冷的PBS洗去盲腸上殘余的內容物；將洗凈的盲腸在培養皿中剪成約1cm³大小的碎塊，轉移至燒杯中，加入10倍體積的酶消化液，37℃水浴中消化45min，并不時的攪拌，使裂殖子充分游離出來；并經四層滅菌紗布過濾，除去大的組織塊和雜質；濾液經3000r/min離心10min；用PBS重懸沉淀，洗滌，3000r/min離心10min；采用紅細胞裂解液重懸沉淀，4℃裂解10min，并不時的攪動，然后2500r/min離心10min；用PBS洗滌沉淀一次，3000r/min離心10min；

用PBS將沉淀稀釋，加入Percoll分離液，配置成30％Percoll懸液；將含30％Percoll的裂殖子懸液緩慢加至50％的Percoll?PBS溶液上面，注意不要破壞液面；3200r/min離心15min后，小心吸取50％的Percoll溶液層到另一干凈的離心管中；用PBS清洗含裂殖子吸出液，3500r/min離心5min后，收集沉淀；PBS洗滌，3500r/min離心5min，沉淀即為獲得的第二代裂殖子；

(二)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因的克隆

(1)E.tenella第二代裂殖子總RNA的提取

總RNA的提取按照Invitrogen公司的Trizol試劑提取操作說明進行；

(2)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3’的擴增

以消減文庫中篩選測序后的序列為EST，以按照clonetech公司SMARTer^TM?RACE?cDNAAmplification?Kit說明書進行基因3’和5’的擴增，

5’RACE?3’primer：為5’-GACAGTTTGCGTGCGTCCGTTGAAG-3’，

3’RACE?5’primer為5’-CCGTCTGCTACCCCTGGCTTTTGTG-3’，擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳分析；

(3)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3’PCR擴增產物的回收及與測序

采用QIAGEN公司的QIA?quick?Gel?Extraction?kit回收基因5’和3’的擴增產物，并與pMD19-T?Vector連接，轉化轉化DH5α感受態細胞，進行藍白斑篩選，挑選白斑菌落過夜培養后，進行PCR鑒定；

(4)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因全長序列的拼接

將測序獲得的3’RACE和5’RACE?PCR產物序列，利用DNAstar軟件查找擴增產物的序列與原EST序列的重疊部分，將三段序列拼接為全長cDNA序列；

(5)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因的擴增與測序

以拼接全長基因序列為基礎，利用Primer?5.0軟件設計上下游引物，以cDNA為模板，全長擴增引物為：Sense?primer：5′-TGCATGCGACAGGATATTTG-3′和Antisense?primer：5′-GCGAAGTTTTCAATGCCAAG-3′，進行RT-PCR擴增全長；反應結束后采用QIAGEN公司的QIA?quick?Gel?Extraction?kit將PCR產物與pMD19-T?Vector連接，轉化DH5α感受態細胞，進行藍白斑篩選，挑選白斑菌落過夜培養后，進行PCR鑒定；

(三)E.tenella第二代裂殖子EtPP蛋白的表達

(1)EtPP表達質粒的構建

以cDNA為模板，根據測序獲得序列及表達載體pET-28a多克隆位點，在目的序列ORF兩端選擇EcoR?I和Not?I酶切位點，

引物序列為：Sense?primer：5′-CTAGAATTCATGGCGGAAGGCAGCGAC-3′和Antisense?primer：5′-GCAGCGGCCGCTTAAATGAAGCTTAGC-3′，利用PCR擴增EtPP基因，對PCR回收產物和pET-28a質粒分別用EcoR?I和Not?I進行雙酶切，純化回收后，T4DNA連接酶連接，并轉化大腸桿菌DH5α細胞，挑取單克隆，PCR及測序證明EtPP基因已正確插入HIS基因的下游，命名為pET-28a-EtPP；

(2)EtPP表達質粒在大腸桿菌中的表達

將鑒定正確的重組表達質粒pET-28a-EtPP轉入大腸桿菌BL21(DE3)宿主細胞，37℃過夜培養，挑取單菌落，接種于含Kan的LB液體培養基中擴大培養，當菌液在37℃培養至OD260大約0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度為0.8mmol/L，37℃誘導表達，在不同的培養時間收集菌體，超聲破碎后，進行SDS-PAGE電泳分析，表達產物主要以包涵體形式存在；

(3)EtPP蛋白的純化

BL21(DE3)表達的EtPP蛋白主要以包涵體的形式存在。取上述菌體，12000r/min，4℃離心15min后取沉淀，PBS洗滌并重懸菌體，冰浴超聲后，12000r/min，4℃離心后收集沉淀，即得純凈的包涵體；然后參照His·Bind樹脂純化法純化包涵體蛋白，SDS-PAGE進行檢測分析。

5.一種利用柔嫩艾美耳球蟲蛋白磷酸酶基因制備抗雞球蟲病藥物的應用。