[發明專利]一種玉米醇溶蛋白基因RNAi載體的構建方法

無效

• 申請號: 201210010542.8
• 申請日: 2012-01-14
• 公開（公告）號: CN102533847A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 陳威;番興明;劉麗;王琨
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院糧食作物研究所;云南田瑞種業有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產權事務所 53113
• 代理人: 康珉

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，特別涉及一種適合單子葉植物遺傳轉化的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體的構建方法。?

背景技術

RNA干擾（RNA?interference，RNAi）是指內源或外源雙鏈RNA（double-stranded?RNA,dsRNA）介導的內源靶基因的mRNA發生特異性降解，進而抑制基因的表達，產生相應的功能表型缺失的現象。RNAi技術目前已成為基因功能研究和作物品質改良的重要方法，其中靶基因RNAi載體的構建是其核心技術。為提高干擾效率，促進RNAi技術在植物遺傳改良中的應用，國內外對RNAi載體的構建方法開展了較多研究。在植物RNA干擾表達載體構建中必需考慮的因素主要有兩個方面：（1）方法簡便、快捷、干擾效率高；（2）構建過程中對骨架載體和導入的目的片段限制較少。

目前，植物RNAi載體構建方法主要有三種，包括以酶切—連接為基礎的RNAi載體傳統構建方法，以同源重組為基礎的植物RNA干擾表達載體構建方法如基于Gateway^TM技術的載體構建及以重組PCR技術為基礎結合酶切—連接的植物RNA干擾載體構建方法。總體而言，傳統RNAi載體構建方法耗時長，但技術比較成熟，適用范圍廣；基于Gateway^TM技術的RNAi載體構建方法是一種簡便、快捷的選擇，適于自動化、高通量的研究工作，但成本較高；如果骨架載體上缺乏所需酶切位點時，基于重組PCR技術的RNAi載體構建方法比較有效，但該技術較新，尚需進一步優化。在利用RNAi技術改良作物品質和植物遺傳改良研究中，所構建的RNAi載體能否成功轉化并達到改良的目的是RNAi技術尚需解決的另一技術問題。

玉米籽粒的蛋白質含量為10%左右，其中50-60％為人畜不能吸收利用的醇溶蛋白。國際玉米小麥改良中心（CIMMYT）在20世紀70年代開始利用隱性突變基因Opaque-2（o2）及其修飾基因將醇溶蛋白含量由55.1%降至22.9%，使賴氨酸含量水平達普通玉米的2倍，進而選育了大批高賴氨酸玉米即優質蛋白玉米并在全世界廣泛應用（譚靜等.優質蛋白玉米育種研究進展.玉米科學?2006,?14(5):15-19），但該方法轉育周期長(7-10年)、效率低、預見性差，加之選育出的高賴氨酸玉米胚乳呈軟質及抗病性差等問題，已越來越不適應現代育種目標的需要。優質蛋白玉米的營養價值相當于牛奶蛋白的90%，在全球許多以玉米為主食的國家和地區均可作為代用營養食品，因此對改善以玉米為主食的人群特別是學齡兒童的營養不良問題有重要意義。此外用優質蛋白玉米為主體的飼料養豬，比普通玉米飼料日增重30%以上，喂雞可提高產蛋量15%以上。研究表明，由于醇溶蛋白特別是22-kD和19-kD醇溶蛋白基因的表達對賴氨酸含量有顯著的負面效應，然而傳統的育種方法難于找到理想的優質種質，獲得賴氨酸含量高而醇溶蛋白低表達的玉米品種難度很大，主要原因在于其表型鑒定即賴氨酸含量測定需要使用高壓液相色譜（HPLC）進行分析，由于HPLC運行成本很高，很難在大規模種質篩選及新品種選育過程中的大批量后代選擇中廣泛應用。因此，如果能通過RNA干擾技術，構建RNAi載體并轉化獲得賴氨酸含量高而醇溶蛋白低表達的轉基因玉米，將是一種簡便，快捷和有效的途徑。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術（利用o2基因及其修飾基因轉育獲得醇溶蛋白含量低而賴氨酸含量高的玉米品種）轉育周期長、效率低、預見性差，以及用現有技術選育出的高賴氨酸玉米品種由于o2基因的連鎖效應導致其籽粒呈軟質胚乳及抗病性差等缺陷和不足，其目的是提供兩個玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD和pUC19-RNAi-19KD的構建方法，實現抑制玉米醇溶蛋白的表達，提高賴氨酸的含量水平的目的。

本發明所提供的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的構建方法，包括以下步驟：

（1）構建含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體pUC19-p22/6?

①胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的獲得

以玉米品種的基因組DNA為模板，以SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示序列為引物對，進行PCR擴增，得到如SEQ?ID?NO:3所示序列的胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6；

②構建含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6序列的重組載體pUC19-p22/6