[發(fā)明專(zhuān)利]一種抗卵白蛋白的單克隆抗體及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210010495.7
• 申請(qǐng)日: 2012-01-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102558350A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任洪林;李巖松;盧士英;柳增善;周玉;劉東;宋杰;張茂林;李兆輝
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/18
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/18;C12N5/20;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

1.一種抗卵白蛋白的單克隆抗體，其特征在于是由下列方法制成的：

（1）免疫健康BALB/C雌性小鼠足墊的快速免疫方法：用1mg/mL的卵白蛋白100μL與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化器乳化40min；使用乙醚將3只BALB/C小鼠分別麻醉后，用酒精棉對(duì)小鼠的兩只后腳掌消毒，皮下注射，每只后腳掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的BALB/C?100μL與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后注射方法同上，首次免疫后14天斷尾采血檢測(cè)小鼠血清效價(jià)；

（2）細(xì)胞融合及陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選與克隆，具體方法如下:

強(qiáng)免后3天的小鼠眼球采血，分離血清留作陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌取出小鼠脾臟，用注射器吸取1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗脾臟以制備脾細(xì)胞懸液，按1：5～10的比例與SP2/0細(xì)胞充分混合，在37℃水浴下與50%PEG1000進(jìn)行細(xì)胞融合；將融合后的細(xì)胞懸液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培養(yǎng)液中，加入事先鋪好飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；并分別于第4天、7天和10天，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況補(bǔ)加或更換HAT培養(yǎng)基；待克隆細(xì)胞生長(zhǎng)至孔底1/4面積以上時(shí)，用間接ELISA法檢測(cè)上清抗體效價(jià)，篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，并選擇陽(yáng)性高、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，然后擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存，直到所有的克隆細(xì)胞孔都為陽(yáng)性為止；先后兩次細(xì)胞融合的融合率分別為20.3%和73.1%，陽(yáng)性率分別為0和1.78%，經(jīng)過(guò)三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株命名為4E9，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)是CGMCC?No.5557，分類(lèi)命名：產(chǎn)雞卵白蛋白單克隆抗體細(xì)胞株；親和力常數(shù)為4.8×10⁸M^-1。

2.如權(quán)利要求1所述的一種抗卵白蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括下列步驟：

（1）免疫健康BALB/C雌性小鼠足墊快速的免疫方法：用1mg/mL的卵白蛋白100μL與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化器乳化40min；使用乙醚將3只BALB/C小鼠分別麻醉后，用酒精棉對(duì)小鼠的兩只后腳掌消毒，皮下注射，每只后腳掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的BALB/C?100μL與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后注射方法同上，首次免疫后14天斷尾采血檢測(cè)小鼠血清效價(jià)；

（2）細(xì)胞融合及陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選與克隆，具體方法如下:

強(qiáng)免后3天的小鼠眼球采血，分離血清留作陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌取出小鼠脾臟，用注射器吸取1640培養(yǎng)基反復(fù)沖洗脾臟以制備脾細(xì)胞懸液，按1：5～10的比例與SP2/0細(xì)胞充分混合，在37℃水浴下與50%PEG1000進(jìn)行細(xì)胞融合；將融合后的細(xì)胞懸液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培養(yǎng)液中，加入事先鋪好飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；并分別于第4天、7天和10天，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況補(bǔ)加或更換HAT培養(yǎng)基；待克隆細(xì)胞生長(zhǎng)至孔底1/4面積以上時(shí)，用間接ELISA法檢測(cè)上清抗體效價(jià)，篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，并選擇陽(yáng)性高、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，然后擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存，直到所有的克隆細(xì)胞孔都為陽(yáng)性為止；先后兩次細(xì)胞融合的融合率分別為20.3%和73.1%，陽(yáng)性率分別為0和1.78%，經(jīng)過(guò)三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株命名為4E9，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)是CGMCC?No.5557，分類(lèi)命名：產(chǎn)雞卵白蛋白單克隆抗體細(xì)胞株；親和力常數(shù)為4.8×10⁸M^-1。

3.如權(quán)利要求1所述的一種抗卵白蛋白的單克隆抗體在制備ELISA?檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。