[發明專利]一種抗卵白蛋白的單克隆抗體及其制備方法

無效

• 申請號: 201210010495.7
• 申請日: 2012-01-13
• 公開（公告）號: CN102558350A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 任洪林;李巖松;盧士英;柳增善;周玉;劉東;宋杰;張茂林;李兆輝
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N5/20;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

1.一種抗卵白蛋白的單克隆抗體，其特征在于是由下列方法制成的：

（1）免疫健康BALB/C雌性小鼠足墊的快速免疫方法：用1mg/mL的卵白蛋白100μL與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化器乳化40min；使用乙醚將3只BALB/C小鼠分別麻醉后，用酒精棉對小鼠的兩只后腳掌消毒，皮下注射，每只后腳掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的BALB/C?100μL與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后注射方法同上，首次免疫后14天斷尾采血檢測小鼠血清效價；

（2）細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的篩選與克隆，具體方法如下:

強免后3天的小鼠眼球采血，分離血清留作陽性對照，無菌取出小鼠脾臟，用注射器吸取1640培養基反復沖洗脾臟以制備脾細胞懸液，按1：5～10的比例與SP2/0細胞充分混合，在37℃水浴下與50%PEG1000進行細胞融合；將融合后的細胞懸液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培養液中，加入事先鋪好飼養細胞的96孔細胞培養板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO₂培養箱中培養；并分別于第4天、7天和10天，根據細胞生長狀況補加或更換HAT培養基；待克隆細胞生長至孔底1/4面積以上時，用間接ELISA法檢測上清抗體效價，篩選陽性雜交瘤細胞，并選擇陽性高、細胞生長狀態好的孔，采用有限稀釋法進行克隆，然后擴大培養、凍存，直到所有的克隆細胞孔都為陽性為止；先后兩次細胞融合的融合率分別為20.3%和73.1%，陽性率分別為0和1.78%，經過三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株命名為4E9，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC?No.5557，分類命名：產雞卵白蛋白單克隆抗體細胞株；親和力常數為4.8×10⁸M^-1。

2.如權利要求1所述的一種抗卵白蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括下列步驟：

（1）免疫健康BALB/C雌性小鼠足墊快速的免疫方法：用1mg/mL的卵白蛋白100μL與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化器乳化40min；使用乙醚將3只BALB/C小鼠分別麻醉后，用酒精棉對小鼠的兩只后腳掌消毒，皮下注射，每只后腳掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的BALB/C?100μL與等量的弗氏不完全佐劑混合均勻后注射方法同上，首次免疫后14天斷尾采血檢測小鼠血清效價；

（2）細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的篩選與克隆，具體方法如下:

強免后3天的小鼠眼球采血，分離血清留作陽性對照，無菌取出小鼠脾臟，用注射器吸取1640培養基反復沖洗脾臟以制備脾細胞懸液，按1：5～10的比例與SP2/0細胞充分混合，在37℃水浴下與50%PEG1000進行細胞融合；將融合后的細胞懸液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培養液中，加入事先鋪好飼養細胞的96孔細胞培養板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO₂培養箱中培養；并分別于第4天、7天和10天，根據細胞生長狀況補加或更換HAT培養基；待克隆細胞生長至孔底1/4面積以上時，用間接ELISA法檢測上清抗體效價，篩選陽性雜交瘤細胞，并選擇陽性高、細胞生長狀態好的孔，采用有限稀釋法進行克隆，然后擴大培養、凍存，直到所有的克隆細胞孔都為陽性為止；先后兩次細胞融合的融合率分別為20.3%和73.1%，陽性率分別為0和1.78%，經過三次克隆化篩選，最后獲得一株能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株命名為4E9，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號是CGMCC?No.5557，分類命名：產雞卵白蛋白單克隆抗體細胞株；親和力常數為4.8×10⁸M^-1。

3.如權利要求1所述的一種抗卵白蛋白的單克隆抗體在制備ELISA?檢測試劑盒中的應用。