[發明專利]一種間充質干細胞的無血清完全培養基

有效

• 申請號: 201210010246.8
• 申請日: 2012-01-13
• 公開（公告）號: CN102634482A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 張瓊;戴成祥;鄧濤
• 申請（專利權）人: 成都美進生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 四川省成都市天策商標專利事務所 51213
• 代理人: 劉興亮

技術領域

本發明涉及細胞培養領域，具體涉及一種間充質干細胞的無血清完全培養基。

背景技術

間充質干細胞是來自中胚層的成體多能干細胞，可從骨髓、骨膜、滑膜、肌肉、脂肪等多種組織中分離出來，具有定向分化為多種類型成熟細胞的潛能。在整個生命過程中，組織器官無論在穩定狀態還是環境改變而受到刺激都需要間充質干細胞來不斷補充更新，因此間充質干細胞成為細胞工程和組織工程理想的種子細胞，然而骨髓等組織中間充質干細胞的數量較少，難以滿足臨床治療和研究方面的需求，因此需要在體外對間充質干細胞進行大量擴增。

目前，間充質干細胞的常規培養體系中均加入了一定比例的動物血清，常用的是胎牛血清。血清在細胞的體外培養體系中是必不可少的，它提供生長因子，結合蛋白，激素，并提供保護作用；然而由于血清成分復雜，且含有一些不利于細胞生長的因子或毒性物質，這些物質可能會影響研究結果，且動物血清還可能因存在病原體，而對臨床應用構成威脅，此外，血清的批次之間存在差異，導致培養結果也出現差異。盡管目前已有很多無血清培養基，但大多還含有少量的動物血清。

發明內容

本發明的目的之一在于解決現有技術的不足，提供一種人間充質干細胞體外培養的無血清完全培養基，克服含血清培養基的血清批次間不穩定、有細胞毒性和大量異源蛋白等缺陷。

本發明另一目的在于在體外對間充質干細胞進行大量擴增。

為達到上述目的，本發明采取了如下技術方案：

一種間充質干細胞的無血清完全培養基，由基礎培養基和添加成份構成，所述的基礎培養基為DMEM/F12，所述的添加成份由重組人胰島素、人血清白蛋白、人轉鐵蛋白、膽固醇、亞硒酸鈉、硝酸鐵和葡聚糖組成。

進一步的技術方案是，所述添加成份中重組人胰島素2～10mg/L，人血清白蛋白1～30g/L，人轉鐵蛋白1～10mg/L，膽固醇10～50mg/L，亞硒酸鈉0.05～0.2mg/L，硝酸鐵1～10mg/L，葡聚糖10～100mg/L。

進一步的技術方案是，所述的基礎培養基DMEM/F12型號包括12400-024、Gibco?884400。

更進一步的技術方案是，所述的無血清完全培養基用于體外培養間充質干細胞，所述的間充質干細胞包含骨髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

(1)本發明的培養基不含有血清，大大避免了含血清培養基的血清批次間不穩定、有細胞毒性和大量異源蛋白等缺陷，為間充質干細胞的基礎研究和臨床治療提供了很好的工具。

(2)本發明在促進細胞增值方面達到了與含血清培養基及其他無血清培養基接近或相當的效果，可支持細胞的長期傳代培養。

附圖說明

圖1為實施例1的流式DNA周期檢測示意圖。

圖2為實施例2的流式DNA周期檢測示意圖。

圖3為實施例3的流式DNA周期檢測示意圖。

具體實施方式

實施例一

1L間充質干細胞無血清完全培養基的配制：將產品型號為12400-024的DMEM/F12干粉(包裝：10袋*1L/盒)1袋，重組人胰島素7mg，人血清白蛋白12g，人轉鐵蛋白1mg，膽固醇25mg，亞硒酸鈉0.185mg，硝酸鐵4mg，葡聚糖50mg混合，加注射用水800ml，攪拌溶解，并用0.5mol/L的鹽酸調節pH至7.1，定容至1L，混勻后用0.22um濾膜過濾除菌，4℃存放。

BMSCs(骨髓間充質干細胞)體外培養：由醫院抽取志愿者骨髓10ml，等體積鋪于1.073g/ml的淋巴細胞分離液上，2250rpm離心30min，取云霧狀單個核細胞層，用生理鹽水洗3次；再依次以2000rpm、1800rpm、1600rpm離心去上清液，每次離心五分鐘；將去上清液后獲得的細胞以上述配制的間充質干細胞無血清培養基重懸并調整密度至5×10⁶cells/ml接種于6孔板中，置37℃5％C0₂飽和濕度培養箱中培養，每隔兩天去上清液更換新鮮的上述配制的間充質干細胞無血清培養基并調整密度至5×10⁶cells/ml，培養10天后細胞匯合度達到85％時消化收獲細胞。