[發(fā)明專利]一種識(shí)別天然結(jié)構(gòu)梅花鹿朊蛋白的單克隆抗體及制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210009101.6
• 申請(qǐng)日: 2012-01-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102558349A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任洪林;柳增善;盧士英;李巖松;周玉;劉東;宋杰;張茂林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;C07K14/47;C12N15/12;C12N15/70;C12N5/20;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢驗(yàn)檢疫快速領(lǐng)域，通過(guò)構(gòu)建重組蛋白，利用重組蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體，并為建立一種梅花鹿朊蛋白雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法提供必需的高效價(jià)、特異性高的單克隆抗體蛋白。?

背景技術(shù)

朊病毒（Prion）是一種由蛋白質(zhì)組成而不含有核酸等遺傳物質(zhì)的病毒。朊病毒(PrP^sc)是生物體內(nèi)普遍存在的正常細(xì)胞型朊蛋白（PrP^c），當(dāng)它由于某種原因結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生錯(cuò)誤折疊并可以抵抗新陳代謝，進(jìn)而聚集擴(kuò)增，最后引起細(xì)胞死亡，最終引起宿主發(fā)生神經(jīng)退行性病變，導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)性死亡。?

朊病毒病作為一種新型疾病，由于它病原的特異性，傳統(tǒng)的消毒措施不能破壞它的傳染性，正常的食物加工過(guò)程中不能有效滅活朊病毒，因此該病對(duì)食品安全造成巨大威脅。當(dāng)瘋牛病在歐洲爆發(fā)時(shí)，英法等國(guó)屠宰牛群達(dá)到100萬(wàn)只以上，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)許多人因?yàn)槭褂昧瞬∨Ｈ庵破房赡茉诮窈蟮膸资旰蟾腥倦貌《静　?

鹿慢性消耗性疾病（Chronic?wasting?disease,CWD）和瘋牛?。˙SE），羊癢疫(Scrapy)，人克雅氏病(CJD)一樣都屬于朊病毒病。鹿慢性消耗性疾病主要感染北美麋鹿、黑尾鹿、白尾鹿等，廣泛分布于北美，主要存在于加拿大和美國(guó)。近幾年，亞洲國(guó)家韓國(guó)在引進(jìn)來(lái)自加拿大的鹿體內(nèi)發(fā)現(xiàn)朊病毒，后證實(shí)病鹿感染鹿慢性消耗性疾病。?

梅花鹿是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，梅花鹿制品品種豐富，具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于PrP^sc可以吸引PrP^c,并將其轉(zhuǎn)化成PrP^sc導(dǎo)致疾病的傳播，而且朊蛋白在各個(gè)物種中均高度保守，梅花鹿朊蛋白和北美麋鹿、黑尾鹿、白尾鹿氨基酸同源性則高達(dá)93%。一旦該病在我國(guó)出現(xiàn)，必將對(duì)我國(guó)的財(cái)政收入、食品安全造成巨大的危害。?

當(dāng)前對(duì)于朊病毒病的檢測(cè)主要是利用PrP^sc抗蛋白酶消化的特點(diǎn)，對(duì)動(dòng)物組織勻漿進(jìn)行消化前后的對(duì)比，既可以判斷該病原是否存在。?

發(fā)明內(nèi)容

?本發(fā)明提供一種識(shí)別天然結(jié)構(gòu)梅花鹿朊蛋白的單克隆抗體及制備方法。?

本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：?

（一）、重組朊蛋白PrP^res?的制備如下：

（1）制備重組朊蛋白PrP^res?基因的人工合成引物為：

???????FW:?GGG?AAT?TCC?ATA?TGA?AGA?AGC?GAC?CAA?AAC?CTG；

???????RV:?CGGATC?CGA?ACT?TGC?CCC?TCG?TTG?GTA；

（2）提取梅花鹿總基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因，克隆至PMD-18T-Simple載體上，將PrP^res?基因片段插入表達(dá)載體pET-Trx中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，pET-Trx-?PrP^res；?將PrP^res?基因片段插入表達(dá)載體pET-His中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，pET-His-?PrP^res；

（3）將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-Trx-?PrP^res和pET-His-?PrP^res轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，得到兩種重組融合蛋白PrP^res-Trx和PrP^res-His，表達(dá)條件為陽(yáng)性克隆培養(yǎng)物以1%接種于LB培養(yǎng)基（50mg/L抗生素），37℃劇烈搖蕩培養(yǎng)至OD600=0.6時(shí)加入終濃度為1mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，220r/min劇烈搖培4h，離心收集菌體，菌體重新PBS懸浮并經(jīng)超聲波裂解，離心分別收集上清和沉淀，通過(guò)SDS-PAGE分別檢測(cè)全菌、上清和沉淀，發(fā)現(xiàn)PrP^res-Trx和PrP^res-His分別以包涵體的形式大量表達(dá)；