[發明專利]一種間充質干細胞及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201210008905.4
• 申請日: 2012-01-12
• 公開（公告）號: CN102517251A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 吳德沛;陳廣華;孫愛寧
• 申請（專利權）人: 蘇州大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61L27/38
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 常亮;李辰

技術領域

本發明涉及細胞工程領域，具體提供了一種間充質干細胞及其制備方法和應用。

背景技術

間充質干細胞最初在骨髓中發現，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。

近年來有文獻報道人臍帶Wharton′s(音譯：華頓氏)膠質也富含間充質干細胞。臍帶間充質干細胞和骨髓來源的間充質干細胞類似，表達一些共有的表面標志物，具有較高自我再生能力，能分化成脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經細胞、心肌細胞及內皮細胞。Baksh?D等實驗結果表明臍帶間充質干細胞增殖能力高于骨髓間充質干細胞。由于骨髓穿刺手術對于供者是有創性手術，而且自采集骨髓液至培養臨床治療數量級的間充質干細胞需要4-6周時間。健康剖宮產臍帶以往屬于醫療廢物，采集臍帶對產婦及新生兒無任何影響，而且制備的合格臍帶間充質干細胞可建立間充質干細胞庫液氮保存，可短期內擴增獲得臨床治療數量級細胞。人臍帶Wharton′s膠質來源的基質細胞在再生治療方面有廣闊的應用前景。

目前國內外文獻報道的培養臍帶來源間充質干細胞方法為低糖DMEM或αMEM培養基添加5-20％胎牛血清，同時可加入人間充質干細胞相關生長因子，如成纖維細胞生長因子FGF或血小板源生長因子PDGF。臍帶間充質干細胞傳代培養至P2代或P3代純度可達到應用于再生治療的要求，現有制備方法在傳代時用豬胰腺提取的胰酶及EDTA.Na₂消化上一代細胞后傳代培養。但是應用現有方法制備的間充質干細胞制品中混雜少量牛血清白蛋白、豬胰酶，二者均是明確的高致敏原，患者接受本方法制備的間充質干細胞懸液會產生對應抗體，降低間充質干細胞治療療效及增加過敏性反應發生，而且有感染包括牛腦海綿狀病在內的牛病毒的潛在風險。

此外，Furlani?D等研究表明利用胎牛血清培養的間充質干細胞有10％以上的細胞直徑大于45μm，細胞直徑越大對于微循環毛細血管床的阻塞作用越明顯，大劑量靜脈輸注試驗條件下嚴重時可導致小鼠死亡，這為患者利用間充質干細胞進行再生治療帶來了潛在的威脅。同時，在傳代時，豬胰酶消化靶點較多，對間充質干細胞的毒性大，進而影響細胞的活力。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種間充質干細胞及其制備方法和應用，使得該制備方法制備的間充質干細胞直徑較小，降低引發過敏性反應的幾率，提高傳代細胞活力。

為實現以上發明目的，本發明提供如下技術方案：

一種間充質干細胞的制備方法，將臍帶去除臍動脈和臍靜脈后切成小塊，用含有0.1％IV型膠原酶的αMEM培養基以及完全培養基消化，然后將臍帶小塊和消化后得到的細胞懸液離心，去上清后洗滌除去膠原酶和膠原，接著用完全培養基重懸，重懸后的懸液轉移至由貼壁基質包被過的培養瓶中培養，至出現梭形貼壁細胞時洗滌除去未貼壁細胞，并更換新的完全培養基繼續培養，以后每2天更換一次完全培養基，至梭形貼壁細胞的匯聚度達到80-85％即得；

所述完全培養基為含有15-25ng/ml?FGF、15-25ng/ml?PDGF、15-25ng/m1人白蛋白、15-25ng/ml胰島素、15-25ng/ml硒酸鈉和15-25ng/ml鐵蛋白的αMEM培養基；

本發明采用的臍帶由蘇州大學第一附屬醫院婦產科提供，采集前經產婦同意并簽署知情同意書。現有制備臍帶間充質干細胞的方法，由于采用胎牛血清，使得間充質干細胞帶有異種動物蛋白，增加其在患者體內引發過敏性反應的幾率，同時現有制備的間充質干細胞直徑較大，在用于再生治療時，會對微循環毛細血管床起阻塞作用，給患者造成威脅。

為此，本發明優化培養基成分，選用新的無血清無動物異種蛋白的完全培養基進行制備，大大減小了間充質干細胞引發過敏性反應的幾率，并且最終制備的間充質干細胞直徑經倒置顯微鏡檢測，平均為26μm，而利用現有方法制備的細胞直徑平均為35μm。同時，經小鼠注射試驗檢測，本發明間充質干細胞注射后小鼠死亡率僅為10％，而現有方法制備的間充質干細胞小鼠死亡率為100％。