[發明專利]一種蠟樣芽孢桿菌普魯蘭酶基因及其應用

無效

• 申請號: 201210008693.X
• 申請日: 2012-01-12
• 公開（公告）號: CN102533818A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 韋宇拓;吳磊;李美容;杜麗琴;黃日波
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/44;C12P19/16;C12R1/085
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 黃永校

技術領域

本發明屬于基因工程和現代酶工程技術領域，具體涉及一種來自蠟樣芽孢桿菌(Bacillus?cereus)的普魯蘭酶基因，該基因表達的海藻糖合成酶可以用于淀粉制糖中提高淀粉原料的利用率，從而提高生產效率。

背景技術

淀粉是一種天然高分子化合物，也是一種重要的工業原料，廣泛存在于植物的根、莖或種子中。天然的淀粉主要由直鏈淀粉與支鏈淀粉組成，直鏈淀粉所占比例較少，約為20％，大部分為支鏈淀粉，約為80％。從結構上來講，支鏈淀粉是一個具有樹枝形分支結構的葡聚糖，一般由1000-300,000個葡萄糖單位連接而成，分子量約為100萬，有些可達600萬。支鏈淀粉的結構為高支化聚合物，葡萄糖單位通過α-1，4-糖苷鍵連接成一直鏈，在直鏈上又可通過α-1，6-糖苷鍵形成側鏈，在側鏈上又會出現另一個分支側鏈。主鏈中每隔6-9個葡萄糖單位就有一個分支，每一個支鏈平均含有約15-18個葡萄糖殘基，平均每24-30個葡萄糖殘基中就有一個非還原尾基。工業上應用的大部分淀粉質原料中支鏈淀粉占總淀粉質量約為70以上，最常用的玉米淀粉中占74％，馬鈴薯淀粉中占76％，木薯淀粉83％，而糯米淀粉的支鏈淀粉含量最高達100％。支鏈淀粉中約含有4～5％的α-1，6-糖苷鍵，淀粉加工領域的α-淀粉酶和β-淀粉酶和糖化酶等葡萄糖淀粉酶對α-1，4糖苷鍵的分解非常容易，但對于α-1，6糖苷鍵的分解很慢，所以α-1，6-糖苷鍵的存在阻礙淀粉的分解，影響到淀粉的利用率和產品的質量，因此在淀粉加工過程都需要添加脫支酶來加快的淀粉的水解速度和提高淀粉的利用率。

普魯蘭酶(Pullulanase，EC?3.2.1.41)是一種脫支酶，它能夠專一性切開支鏈淀粉分支點中的α-1，6-糖苷鍵，形成α-1，4糖苷鍵的直鏈淀粉，在以淀粉為原料的制糖加工業中，可以顯著提高淀粉原料的利用率，降低生產成本和提高產品質量。在淀粉水解過程中，利用普魯蘭酶與α-淀粉酶、糖化酶配合使用，將淀粉徹底降解為葡萄糖對生產高質量的葡萄糖特別是醫用葡萄糖時特別重要。在生產麥芽糖生產中用普魯蘭酶將支鏈淀粉脫支而形成短的直鏈淀粉片段，有利于β-淀粉酶的作用，減少β-極限糊精的形成，從而提高麥芽糖的含量，所以普魯蘭酶在生產含量在70％的以上的超高麥芽糖漿中極為重要。

1961年Bender和Wallenfels通過產氣氣桿菌(Aerobacter.aerogenes)發酵獲得普魯蘭酶以后，各國的科研人員經過廣泛深入研究，從不同的地區、微生物中獲得該酶，掀起了開發普魯蘭酶的高潮。近年來，國內對普魯蘭酶的研究主要集中在耐酸耐熱高產菌株的篩選及基因的克隆與表達。國內食品工業上所用的普魯蘭酶均是從丹麥NOVO進口

普魯蘭酶的來源有很多種，包括產氣氣桿菌、放線菌、酸假孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、棲熱水生菌等。但是這些來源的普魯蘭酶其酶學性質與淀粉工業耐酸(pH4.6)、耐熱(75℃)的要求相差較大，因此，目前國內外大多數普魯蘭酶研究工作主要集中在通過各種方法獲得優良普魯蘭酶產生菌種上，而短小芽孢桿菌正是研究的熱點之一。其中來源于Brevibacillus?brevis和Bacillusderamificans的普魯蘭酶已經實現商業化生產。B.brevis普魯蘭酶由經過遺傳改良的B.brevis直接發酵生產；B.deramificans的普魯蘭酶則使用地衣芽胞桿菌重組菌進行生產，生產水平在100單位/mL發酵液～400單位/mL發酵液不等。目前國際上普魯蘭酶的工業化生產被丹麥壟斷，我國僅局限于實驗室研究，且酶活較低，所以開發普魯蘭酶對食品加工領域具有重要的工業價值。

通過檢索，還查到有關普魯蘭酶的一些科技文獻：中國專利申請201010256287.6公開了一種來源于芽孢桿菌的胞外普魯蘭酶編碼基因及其應用，篩選到一株具有普魯蘭分解能力的芽孢桿菌Bacillus?sp.042，利用反向PCR技術克隆了普魯蘭酶編碼基因pulA042編碼區完整序列，序列分析顯示該基因編碼區全長2571堿基，編碼一856個氨基酸殘基的多肽鏈，多肽鏈N端32個氨基酸殘基組成一典型的信號肽，因此基因pulA042編碼一種胞外普魯蘭酶。Bacillus?sp.042普魯蘭酶基因pulA042的表達產物具有分解普魯蘭和紅色普魯蘭的活性，能降解淀粉中α-1，6糖苷鍵，不降解α-1，4糖苷鍵，是一種I型普魯蘭酶。利用基因pulA042生產的重組酶在淀粉加工中用于分解淀粉或糊精分子中α-1，6糖苷鍵。