[發明專利]一種灰色鏈霉菌海藻糖合成酶基因及其應用

無效

• 申請號: 201210008691.0
• 申請日: 2012-01-12
• 公開（公告）號: CN102533801A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 韋宇拓;梁甲元;杜麗琴;黃英
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;C12P19/12
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 黃永校

技術領域

本發明屬于基因工程和現代酶工程技術領域，具體涉及一種來灰色鏈霉菌的海藻糖合成酶基因，該基因表達的海藻糖合成酶可以用于生產海藻糖。

背景技術

海藻糖是由兩分子葡萄糖以α，α-1，1糖苷鍵相連而成的非還原性二糖，廣泛地存在于微生物、蝦類、釀酒酵母、蘑菇及各種真菌、昆蟲、植物等。外源性的海藻糖同樣對生物體及生物大分子、生物膜具有良好的非特異性保護作用，它可以保護細胞免受由于環境變化(如脫水、高滲)變化后造成的損害，具體表現為對生物膜、蛋白質和DNA等的有效保護，因此被譽為“生命之糖”。天然中海藻糖的含量很低，過去主要是從干酵母中提取，由于含量低，提取過程較復雜，成本極高。如此昂貴的海藻糖只能局限于某些特殊領域如醫學生物制品的活性保持的應用，隨著人類社會的發展和進步，希望能將海藻糖應用于日常生活所常用各類食品的鮮味保持與質地改善，更好提高人們的生活和健康水平，因此必須要盡快地找到廉價而高效的海藻糖制造方法。

目前已經在多種微生物中分離到多種不同類型的海藻糖合成酶及其相關的基因，目前發現的海藻糖合成相關酶和基因表明，微生物中合成海藻糖的途徑可以分為三種途徑，第一種途徑是海藻糖磷酸化酶合成途徑，主要由徑6-磷酸海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate?synthase)和6-磷酸海藻糖酯酶(Trehalose-6-phosphate?phosphatase)組成，首先由6磷酸海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，然后再由6磷酸海藻糖酯酶脫磷酸后得到海藻糖；第二種途徑是麥芽寡糖基海藻糖合成酶合成途徑，主要是由麥芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyltrehlosen，MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose?trehalohydrolase，MTHase)組成，先由麥芽寡糖基海藻糖合成酶以麥芽糊精(Maltodextrin)為底物，通過分子內轉糖基作用把麥芽糊精末端的兩個葡萄糖分子間的α，α-1，4糖苷鍵轉變成α，α-1，1糖苷鍵，形成麥芽寡糖基海藻糖(Maltooligosyltrehalose)。然后麥芽寡糖基海藻糖在麥芽寡糖基海藻糖水解酶的催化下從麥芽寡糖基海藻糖分子上水解下一個海藻糖分子，而原來的麥芽糊精則轉變為減少了兩個葡萄糖基的新寡糖，并可作為新的底物進行下一輪反應，如此反復就可以將麥芽糊精轉化成海藻糖；第三種途徑是海藻糖合成酶途徑，與其它海藻糖合成途徑不同是這種途徑只有一種酶即海藻糖合成酶(Trehalose?synthase，Tre?S)組成，它作用的底物是麥芽糖(Maltose)，通過催化麥芽糖分子內轉糖基，將α，α-1，4糖苷鍵連接的麥芽糖轉化為α，α-1，1糖苷鍵，麥芽糖轉變成海藻糖。第一種途徑需要用到價格昂貴的高能磷酸化合物UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖為底物來生產海藻糖，在生產成本很難產生競爭優勢，第二種和第三種途徑是以淀粉的水解產物麥芽糊精或者麥芽糖為底物生產海藻糖，具有很強的競爭優勢，第三種途徑和第二種途徑相比，第三種途徑只需要一種酶，因此在利用基因工程菌生產酶時不需構建兩種工程菌，在生產過程設備的占用率會更低，而且不需要考慮兩種酶的反應條件是否一致，這樣可以使生產工藝上會更簡單，因而具有更強的競爭優勢。

目前已有不少文獻和專利報道了海藻糖合成相關基因的克隆和分離，以及這些海藻糖合成酶基因的相關酶用于制備海藻糖，但這些海藻糖合成相關酶的合成途徑不同，或者菌種來源不同，導致了DNA序列和氨基酸序列相差甚遠，酶的分子量、酶學特性以及酶對底物的轉化率，而且目前都還沒有得到工業規?；膽?。

發明內容

本發明目的是提供一種灰色鏈霉菌海藻糖合成酶基因及其應用，在轉化麥芽糖生成海藻糖時能產生較高的海藻糖及產生較少的葡萄糖，并能避免生產過程中水和原料中金屬離子對酶活力的抑制，有利于提高生產工藝的穩定性。

本發明人利用生物信息手段對GenBank中龐大的DNA序列和氨基酸序列資源進行同源性檢索分析，對已經完成序列分析的上千種微生物的DNA序列進行大量核酸序列進行分析和對比，發現了在蛋白質的序列數據庫Genbank中注釋為“未知蛋白”或“推測是某功能蛋白質”的極為有用基因，推測該序列的功能，然后找到候選基因序列然后進行實驗的功能鑒定，最終確定基因的功能和性質，其中包括至今為止人們并未發現的海藻糖合成酶基因(treS)，并用這種合成酶基因經過克隆和進行重組表達，再利用重組表達的海藻糖合成酶用于轉化麥芽糖生產海藻糖。