[發(fā)明專利]構(gòu)建的一個(gè)連作棉田土壤宏基因組文庫(kù)

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210008113.7
• 申請(qǐng)日: 2012-01-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103205816A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新疆師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C40B40/02
• 分類號(hào): C40B40/02;C40B50/06;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及土壤微生物、生物化學(xué)及分子生物學(xué)等領(lǐng)域，特別是把從新疆不同連作年限棉田土壤中分離純化出土壤微生物30kb-150kb大片段的DNA連接到BAC載體中構(gòu)建成宏基因組文庫(kù)，該文庫(kù)中包含有不同連作年限棉田土壤中原核和真核微生物各種染色體內(nèi)部基因及其調(diào)控信息。?

本發(fā)明針對(duì)新疆連作棉田中孕育的大量生物基因資源，利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)手段從不同連作年限棉田土壤中分離微生物大片段DNA并連接到宏基因組載體當(dāng)中，在未培養(yǎng)的情況下直接獲得了各種連作年限棉田土壤生態(tài)環(huán)境中各種微生物基因資源。該文庫(kù)可用于篩選各種不同連作年限棉田微生物資源基因和研究生物基因調(diào)控原理等。?

技術(shù)背景

從1929年發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，人們已經(jīng)從微生物中開(kāi)發(fā)了一百多種臨床使用的抗生素，抗癌和抗病毒藥物。然而，近些年來(lái)人類、家畜以及栽培作物病原菌抗(耐)藥性迅速發(fā)展，新的傳染病隱患日益加深，但是從可培養(yǎng)微生物中發(fā)現(xiàn)新型生物活性物質(zhì)的研究卻舉步為艱，為此科學(xué)家們不斷的調(diào)整研究的材料以及方法，試圖高效而持續(xù)的從各種環(huán)境中開(kāi)發(fā)出豐富的微生物資源。?

土壤微生物是最有價(jià)值的天然產(chǎn)物來(lái)源，它們能提供許多工業(yè)上十分重要的抗生素以及生物催化劑。各種微生物都有驚人的產(chǎn)生多樣化次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力。Hammond估計(jì)地球上的微生物物種多達(dá)16×10⁹，廣泛分布于各種生態(tài)系統(tǒng)中，其中，土壤無(wú)論從微生物數(shù)量和種類上都是首屈一指的生境。有人用科學(xué)的方法估計(jì)1克土壤中約有大于10000種不同的微生物，因此，土壤是微生?物的大本營(yíng)。但是，運(yùn)用現(xiàn)有的技術(shù)，只有0.2％～2％的土壤微生物是可培養(yǎng)的，因此土壤中孕育著大量未被開(kāi)發(fā)的生物基因資源。利用土壤環(huán)境下的未培養(yǎng)微生物資源是工業(yè)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)的一個(gè)全新領(lǐng)域，也是人類尋找新型功能活性物質(zhì)和天然藥物的天然寶庫(kù)，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。?

過(guò)去十多年在環(huán)境微生物培養(yǎng)和高新生物技術(shù)上的發(fā)展，特別是在基因組相關(guān)技術(shù)上的飛速發(fā)展，為我們從分子水平上了解環(huán)境微生物及其生態(tài)功能多樣性提供了諸多的便利。首先：隨著基因組技術(shù)的發(fā)展，人們開(kāi)始用分子生物學(xué)的方法來(lái)研究微生物間的進(jìn)化關(guān)系和遺傳信息的功能關(guān)系。環(huán)境基因組又稱多源基因組或宏基因組，是指從環(huán)境中提取總的DNA，對(duì)其進(jìn)行遺傳學(xué)和功能學(xué)的研究。優(yōu)點(diǎn)是不但可以原始地反映環(huán)境樣品中所有生物的遺傳多樣性，避開(kāi)難培養(yǎng)這一技術(shù)瓶頸，而且可以把細(xì)胞外的DNA一并研究。通過(guò)環(huán)境基因組的方法可以獲得越來(lái)越多的DNA序列，且大都是新穎的未被純培養(yǎng)微生物的序列。運(yùn)用環(huán)境基因組序列不但可以使我們逐漸了解微生物群落功能的復(fù)雜性，以及微生物間的相互作用關(guān)系，而且可以使我們深入了解未被純培養(yǎng)微生物的生理和生態(tài)特征。研究藥物發(fā)現(xiàn)相關(guān)的新穎基因，自然也要把目標(biāo)鎖定在環(huán)境基因組中編碼新穎次級(jí)代謝產(chǎn)物的基因上。?

與其他基因工程技術(shù)不同，土壤環(huán)境基因組技術(shù)所需要的DNA片段不是來(lái)自已知菌中已熟知的基因片段或基因簇，而是來(lái)自完全未知的土壤樣品中，對(duì)其可能具有的潛在功能也并不知曉。在土壤總DNA中，編碼次級(jí)代謝產(chǎn)物的基因經(jīng)常是成簇存在的，與同一個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)的基因的生物合成區(qū)域和調(diào)節(jié)區(qū)域經(jīng)常是緊密相連的。這些相連的基因使得克隆到載體中整個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物途徑基因是一個(gè)連續(xù)的片段。在藥物發(fā)現(xiàn)中，生物合成基因和抗性基因也是連在一個(gè)片段上的，對(duì)于有毒的代謝產(chǎn)物，宿主可以通過(guò)共表達(dá)的抗性基因帶?來(lái)的抗性機(jī)制來(lái)避免毒性。這一特點(diǎn)不但簡(jiǎn)化了對(duì)外源片段進(jìn)行剪切和修飾程序，而且使重組子的篩選更加方便，無(wú)疑為功能基因的克隆和表達(dá)提供了便利。?

其次：宏基因組(metagenomics)工程，直接將特定環(huán)境中的總體遺傳物質(zhì)，克隆到可培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中，建立宏基因組文庫(kù)，從所獲得的重組克隆子中篩選活性物質(zhì)和相關(guān)基因(簇)，避開(kāi)了環(huán)境微生物分離培養(yǎng)的難題，在挖掘和利用未培養(yǎng)微生物資源，篩選新穎生物活性物質(zhì)方面具有極大的潛力。?