[發明專利]慢生大豆根瘤菌提高萊茵衣藻產氫量的方法

有效

• 申請號: 201210007835.0
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102732563A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 吳雙秀
• 申請（專利權）人: 中國科學院北京基因組研究所
• 主分類號: C12P3/00
• 分類號: C12P3/00;C12R1/89;C12R1/41
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物制氫技術，具體地說是利用慢生大豆根瘤菌提高萊茵衣藻產氫量的方法。

背景技術

能源危機與環境污染都是當今世界面臨的突出問題，氫氣是一種清潔、燃燒值高、利用形式多樣的可再生生物能源^[1]。光合生物制氫技術能直接轉化太陽能為氫能，特別是微藻光合制氫的底物是水，來源豐富，是利用太陽能生產氫氣的理想模式。而且微藻培養容易，不占用可耕地，是目前國際上生物制氫領域的研究熱點^[2]。萊茵衣藻(Chlamydomonas?reinhardtii)因為其氫化酶活性高、培養容易、生長速度快、遺傳學背景清晰和轉化容易等原因被選為生物制氫研究的模式物種^[3]。但是，衣藻的氫化酶活性很容易受氧氣的抑制而失去活性^[3，4]，而氧氣又是衣藻光合作用的主要產物，是導致了衣藻產氫效率低的主要原因，所以要提高衣藻氫氣產量就要降低其細胞內氧氣的含量。

目前降低衣藻細胞內氧氣含量的方法主要是通過去除培養基中硫元素來抑制光合系統II活性、進而降低光解水產生的氧氣、提高氫化酶的活性和延長產氫時間^[5]。應用該方法發展而來的兩步法萊茵衣藻產氫技術是目前產氫效率最高的技術，該技術是在第一階段使用正常TAP培養基，進行萊茵衣藻的營養生長，以獲得最大生物量的積累，在第二階段更換缺硫培養基，進行產氫培養，獲得氫氣。但是該方法同時抑制了光解水所產生的電子產量，最終仍然不能滿足工業生產的需求^[3-5]。因此，要提高衣藻的產氫效率就需要既降低細胞內的氧濃度又要保障電子的供應。

豆科植物根瘤中的固氮酶與氫酶有相似的特性，也對氧氣敏感，但是根瘤中的固氮酶卻有很高的固氮活性，這與根瘤細胞中含有大量的豆血紅蛋白leghemoglobin，簡稱Lb，有著密切的關系，它對氧氣具有極高的親和力和快速的氧周轉率，能促進氧氣在細胞內的擴散并將氧氣運輸給呼吸作用，有效降低了根瘤細胞內類菌體周圍的氧濃度，保證了同樣對氧氣敏感的固氮酶的活性，同時也保障了呼吸作用需氧和固氮作用需要的大量能量^[6-9]。中國專利CN200380107352.7和CN02138702.8分別公開了利用表達豆血紅蛋白改變植物貯藏儲備物含量和提高植物抗澇能力。生物發酵工程的已有技術中也有應用其它血紅蛋白體外重組表達而使產量提高的報導。

豆血紅蛋白有兩個亞基構成，一個是球蛋白亞基，由豆科植物合成；另一個是血紅素輔基，由共生的根瘤菌合成，兩個亞基結合成為有活性的豆血紅蛋白^[6]。本發明人曾將大豆血紅蛋白球蛋白亞基lba基因轉入萊茵衣藻葉綠體中表達使轉基因萊茵衣藻產氫量提高了50％(中國發明專利申請CN201010107922.4)；

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用根瘤菌提高轉基因萊茵衣藻產氫量的方法，并提供一種新思路，用于指導基因工程技術改造萊茵衣藻及其它具有相似代謝特征的微藻產氫代謝途徑的方法，使之更適合于在與根瘤菌共培養的兩步法產氫技術中提高萊茵衣藻或其它微藻生物量的累積和進一步促進產氫量的方法。

本發明將慢生大豆根瘤菌與葉綠體中轉化了大豆血紅蛋白球蛋白亞基lba基因的轉基因萊茵衣藻lba進行共培養，發現可以進一步提高轉基因衣藻lba的生物量積累和顯著促進其產氫量的增加。本發明的方法為指導基因工程技術改造衣藻萊茵衣藻和在兩步法產氫技術中進一步提高產氫量提供新思路和實驗基礎。隨著生物制氫技術的發展，本發明將顯現出越來越大的實用性和重要性

本發明一方面提供了一種在兩步法產氫技術中提高萊茵衣藻產氫量的方法，其特征在于將慢生大豆根瘤菌與萊茵衣藻共培養。

在一個實施方案中，所述萊茵衣藻為萊茵衣藻藻株cc849(Chlamydomonas?reinhardtii?strain?cc849)。

優選地，所述萊茵衣藻為葉綠體中轉化了豆血紅蛋白球蛋白亞基lba基因的轉基因萊茵衣藻藻株lba。

在最優選的實施方案中，在共培養體系中慢生大豆根瘤菌的濃度為OD₆₀₀＝1、萊茵衣藻的細胞濃度為12.5mg葉綠素/L，藻液與菌液的體積比為40∶1，共培養體系的產氫量最大。

本發明的另一方面提供了慢生大豆根瘤菌在兩步法產氫技術中提高萊茵衣藻產氫量的用途。

在一個實施方案中，所述萊茵衣藻為萊茵衣藻藻株cc849。