[發(fā)明專利]利用細(xì)菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)提高產(chǎn)氫量的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210007637.4
• 申請(qǐng)日: 2012-01-11
• 公開（公告）號(hào): CN102559832A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳雙秀
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院北京基因組研究所
• 主分類號(hào): C12P39/00
• 分類號(hào): C12P39/00;C12P3/00;C12R1/01;C12R1/38;C12R1/89
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制氫技術(shù)，具體地是一種將細(xì)菌和萊茵衣藻共培養(yǎng)提高產(chǎn)氫量的方法。

背景技術(shù)

能源危機(jī)與環(huán)境污染都是當(dāng)今世界面臨的突出問題，氫氣是一種清潔、燃燒值高、利用形式多樣的可再生生物能源^[1]。光合生物制氫技術(shù)能直接轉(zhuǎn)化太陽能為氫能，特別是微藻光合制氫的底物是水，來源豐富，培養(yǎng)容易，不占用可耕地，是利用太陽能生產(chǎn)氫氣的理想模式，成為目前國際上生物制氫領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)^[2]。萊茵衣藻(Chlamydomonas?reinhardtii)因?yàn)槠錃浠富钚愿摺⑴囵B(yǎng)容易、生長速度快、遺傳學(xué)背景清晰和轉(zhuǎn)化容易等原因被選為微藻制氫研究的模式物種^[3]。但是，衣藻的氫化酶活性很容易受氧氣的抑制而失去活性^[3，4]，而氧氣又是衣藻光合作用的主要產(chǎn)物，是導(dǎo)致了衣藻產(chǎn)氫效率低的主要原因。

目前降低萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)氧氣含量的方法主要是通過去除培養(yǎng)基中硫元素來抑制光合系統(tǒng)II活性、進(jìn)而降低光解水產(chǎn)生的氧氣^[5]，但是該方法同時(shí)抑制了光解水所產(chǎn)生的電子產(chǎn)量，最終仍然導(dǎo)致產(chǎn)氫效率低^[3-5]。因此，要提高萊茵衣藻的產(chǎn)氫效率就需要既降低細(xì)胞內(nèi)的氧濃度又要保障電子的供應(yīng)。

目前最有效的萊茵衣藻產(chǎn)氫技術(shù)為兩步法培養(yǎng)技術(shù)，即第一步為在正常TAP培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)萊茵衣藻，以獲得最大生物量；然后收集萊茵衣藻在缺硫培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)氫培養(yǎng)，最大限度獲得氫氣產(chǎn)量。

萊茵衣藻在大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)很容易污染其它細(xì)菌等微生物，在實(shí)驗(yàn)室繼代培養(yǎng)過程中也很容易污染一些細(xì)菌，并且有些細(xì)菌能與萊茵衣藻長期共棲，不顯著影響萊茵衣藻的生長。本發(fā)明對(duì)在實(shí)驗(yàn)室繼代培養(yǎng)過程中與萊茵衣藻藻株cc849(以下簡稱衣藻)共棲的細(xì)菌進(jìn)行了分離純化，得到三株分離菌，命名為L2、L3和L4，經(jīng)16S?rRNA系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析鑒定，分別與嗜麥芽寡食單胞菌(Stenotrophomonas?maltophilia)菌株776、微桿菌(Microbacterium?paraoxydans)菌株591和假單胞菌(Pseudomonas?sp.)菌株A8的16S?rRNA序列的相似性達(dá)到99％，100％和99％。

由于豆科植物根瘤中的固氮酶與萊茵衣藻氫化酶具有相似的特性，都對(duì)氧氣敏感，但是固氮酶在自然環(huán)境中具有高效固氮活性，是因?yàn)楦鲋杏懈鼍木壒省Ｒ虼吮景l(fā)明還選取了慢生大豆根瘤菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)，驗(yàn)證其對(duì)萊茵衣藻生長和產(chǎn)氫的影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用細(xì)菌和萊茵衣藻共培養(yǎng)提高產(chǎn)氫量的方法，使之更適合于萊茵衣藻及其它微藻兩步法產(chǎn)氫技術(shù)中的第二階段增加氧氣消耗和提高產(chǎn)氫量的方法。

本發(fā)明將上述三株分離菌和一株慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium?japonicum)(以下簡稱根瘤菌)分別與純凈的萊茵衣藻藻株cc849在兩步法產(chǎn)氫技術(shù)的第一階段和第二階段按一定體積比混合進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果表明：在第一階段的營養(yǎng)生長時(shí)期，假單胞菌對(duì)衣藻的生長有抑制作用，其它三種細(xì)菌無顯著影響。在第二階段的產(chǎn)氫培養(yǎng)時(shí)期，上述四種細(xì)菌都能顯著提高衣藻的產(chǎn)氫量，其最大產(chǎn)氫量分別是純凈萊茵衣藻cc849產(chǎn)氫量的4.0倍、2.9倍、4.1倍和5.5倍。對(duì)藻菌共培養(yǎng)體系內(nèi)氧氣含量的檢測(cè)表明呼吸耗氧的增加是細(xì)菌-衣藻共培養(yǎng)體系產(chǎn)氫量提高的主要原因。本發(fā)明的方法為衣藻兩步法產(chǎn)氫技術(shù)中進(jìn)一步提高產(chǎn)氫量提供新方法，隨著生物制氫技術(shù)的發(fā)展，本發(fā)明將顯現(xiàn)出越來越大的實(shí)用性和重要性。

本發(fā)明方法的要點(diǎn)是：

本發(fā)明提供了一種在萊茵衣藻兩步法制氫技術(shù)中的第二階段，向衣藻培養(yǎng)體系中加入一定量的某種細(xì)菌以增加培養(yǎng)體系內(nèi)呼吸耗氧和提高產(chǎn)氫量的方法及具體實(shí)施辦法。

本發(fā)明所使用的某種細(xì)菌是這樣選取的：在與萊茵衣藻藻株cc849共棲的細(xì)菌中分離并純化出了三株細(xì)菌L2、L3和L4，經(jīng)16S?rRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化學(xué)分析，分別鑒定為嗜麥芽寡食單胞菌(Stenotrophomonas?maltophilia)菌株776、微桿菌(Microbacterium?paraoxydans)菌株591和假單胞菌(Pseudomonas?sp.)菌株A8。它們都是能與萊茵衣藻共棲的好氧細(xì)菌。慢生大豆根瘤菌的選擇是由于豆科植物根瘤中的固氮酶與萊茵衣藻氫化酶具有相似的特性，都對(duì)氧氣敏感，但是固氮酶在自然環(huán)境中具有高效固氮活性，是因?yàn)楦鲋杏懈鼍木壒省?/p>