[發(fā)明專利]一株木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母菌株及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210007431.1
• 申請(qǐng)日: 2012-01-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102559527A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鮑曉明;沈煜;汪城墻
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/31;C12N15/63;C12R1/865
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母重組菌株，該菌株表達(dá)了克隆自谷氨酸棒狀桿菌Corynebacterium?glutamicum的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE的表達(dá)提高了釀酒酵母菌株對(duì)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。本發(fā)明還涉及該木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的菌株在構(gòu)建可代謝木糖的重組釀酒酵母中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，能源緊缺問(wèn)題受到世界各國(guó)的廣泛關(guān)注，用可再生資源生產(chǎn)能源物質(zhì)來(lái)代替非再生的化石資源對(duì)未來(lái)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展具有重大的意義。我國(guó)，以農(nóng)業(yè)廢棄物為主的木質(zhì)纖維素原料是年產(chǎn)量巨大的可再生生物質(zhì)資源，以之作為新能源物質(zhì)的生產(chǎn)原料對(duì)促進(jìn)可持續(xù)發(fā)展和保障國(guó)家安全具有戰(zhàn)略意義。木質(zhì)纖維素原料水解后，會(huì)產(chǎn)生大量單糖，其中，主要成分是葡萄糖，其次是木糖和阿拉伯糖。木糖在水解液中含量可達(dá)到總糖的30％，其有效利用是木質(zhì)纖維素實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)化大生產(chǎn)的必要條件。

釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)是廣泛使用于食品及化工工業(yè)的生產(chǎn)菌株，具有抗逆性強(qiáng)、發(fā)酵條件易控制、遺傳背景清楚、食品級(jí)安全等許多優(yōu)良特性，是優(yōu)秀的細(xì)胞工廠菌株。但天然的釀酒酵母菌株并不能發(fā)酵木糖。不同來(lái)源木糖代謝途徑的引入可以使釀酒酵母利用木糖，但利用效率仍舊不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。制約酵母對(duì)木糖利用的瓶頸問(wèn)題主要有兩個(gè)：①酵母木糖代謝效率還有待進(jìn)一步提高；②酵母對(duì)木糖的攝取效率偏低。

天然的釀酒酵母通過(guò)非特異性己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(主要有Hxt1、Hxt2、Hxt4、Hxt5和Hxt7)和半乳糖透性酶(Gal2)攝取木糖，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都屬于主要易化子超家族(Major?Facilitator?Superfamily，MFS)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)木糖的親和性較低，其Km值是葡萄糖的10～100倍，因此，木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)受到葡萄糖的強(qiáng)烈抑制。異源表達(dá)高親和力木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或提高現(xiàn)有木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的親和力，對(duì)提高釀酒酵母的木糖代謝的研究十分重要。到目前為止，已報(bào)道了部分真菌來(lái)源的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在釀酒酵母中的異源表達(dá)，并且可以促進(jìn)菌株對(duì)木糖的利用，例如，來(lái)源于間型假絲酵母(Candida?intermedia)的Gxf1、樹(shù)干畢赤酵母(Pichia?stipitis)的Sut1和擬南芥(Arabidopsis?thaliana)中的At5g5920等，但要滿足構(gòu)建高效木糖利用重組釀酒酵母的需求，尚需要對(duì)木糖的親和力更高的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。2009年，Hideo等人從十種谷氨酸棒狀桿菌中篩選到了一株可利用阿拉伯糖為唯一碳源的菌株Corynebacterium?glutamicum?ATCC31831，其利用阿拉伯糖的能力是利用葡萄糖的2倍，在此種菌株中不受葡萄糖代謝抑制(CCR機(jī)制)的影響。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)了具有高活性阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力的AraE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并且此轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)木糖的利用同樣有較明顯的促進(jìn)作用。推測(cè)，此蛋白在谷氨酸棒狀桿菌中是戊糖誘導(dǎo)的高親和性質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在低濃度阿拉伯糖和木糖培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)運(yùn)效果明顯，其超表達(dá)可使谷氨酸棒狀桿菌的戊糖消耗速率提高3倍，可使戊糖與葡萄糖同時(shí)被利用，即AraE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不受葡萄糖抑制。此蛋白的優(yōu)良特性使其在釀酒酵母中具有潛在的篩選木糖專一性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究?jī)r(jià)值。

釀酒酵母內(nèi)源的木糖運(yùn)輸?shù)鞍资悄?nèi)在蛋白，主要含有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其功能表達(dá)需要正確定位在細(xì)胞膜上。細(xì)菌和真菌的細(xì)胞膜骨架雖均為脂雙層結(jié)構(gòu)，但兩者含有不同的附屬物，如固醇類物質(zhì)、膜蛋白等，造成兩者化學(xué)組成存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致質(zhì)膜間的不相容性，另外，細(xì)菌和真菌細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)和膜蛋白輔助調(diào)節(jié)因子均存在差異，造成了細(xì)菌源的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在釀酒酵母菌株中正確表達(dá)、膜定位和發(fā)揮完整功能的難度。至今，尚缺少關(guān)于細(xì)菌源木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在釀酒酵母中功能表達(dá)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一株木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的釀酒酵母菌株，該菌株表達(dá)了克隆自谷氨酸棒狀桿菌Corynebacterium?glutamicum的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因araE的表達(dá)提高了釀酒酵母菌株對(duì)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。本發(fā)明還提供了該木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力高的菌株在構(gòu)建可代謝木糖的重組釀酒酵母中的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：