[發明專利]一種基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統及其應用

有效

• 申請號: 201210007398.2
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN103087969A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 劉愛驊;梁波
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/62;C12Q1/32
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及生物技術和分析技術領域，具體的說是一種基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統及其在木糖快速檢測中的應用。

背景技術

木糖是一種重要的碳水化合物，在人們的生產生活中具有非常重要的作用。在自然界中，天然D-木糖是以多糖的形態存在于植物中，它們在農產品的廢棄部分中(例如玉米的穗軸、秸稈、棉桃的外皮)含量很高，木糖是其自然降解和人為降解中的重要產物。利用木糖發酵生產乙醇可以提高原料的利用率和燃料乙醇的產量，降低燃料乙醇的生產成本，因此目前已經受到越來越多的關注。在細菌中有的能利用D-木糖作為碳源生長，在動物中羊幾乎能完全地利用木糖。在動物的蛋白多糖中D-木糖與多肽鏈的絲氨酸殘基以糖苷鍵連接，成為多糖側鏈與蛋白質的橋接結構。木糖醇是木糖通過加氫制得的，其用途非常廣泛。在發達國家木糖已應用于寵物飼料。木糖可以作為糖尿病人的耐受性好的無熱量甜味劑、營養劑和治療劑。它還可以作為加熱食品增香劑，用于焙烤食品、火腿、香腸、臘肉、人造肉等。木糖還被廣泛應用于肉食加工、肉類香料以及制備食品抗氧劑等方面。另外，木糖已作為軟化劑、離子表面活性劑、增塑劑、水分調節劑等用于油漆、牙膏、卷煙、制革、鑄造、火藥等多種行業。因此，快速、高靈敏度、高選擇性、實時的木糖檢測對遺傳、人類營養、食品技術、醫藥以及包括生物燃料在內的生物過程等領域極其重要。

目前，木糖的檢測方法有還原法、酶學方法、色譜法、拉曼光譜法和紅外光譜法等。但是這些方法存在各種各樣的問題，例如，采用還原法檢測時，其靈敏度較低，而且易受到其他有顏色和還原性物質的干擾；在酶學方法中，酶的來源和純化是個至關重要的問題；色譜法包括氣相色譜法、液相色譜法和離子色譜法，存在的主要問題是樣品制備過程復雜、操作費時、誤差較大、需要昂貴設備等。因此，建立一種快速、靈敏、特異的木糖實時檢測方法，勢在必行。

酶學方法的優點是靈敏度高、特異性好，但是酶的純化和穩定性是難以解決的問題。木糖脫氫酶(XDH)(EC?1.1.1.175)是一些微生物中木糖代謝途徑的關鍵酶。木糖在木糖脫氫酶的催化下，借助于輔酶NAD⁺，被氧化成木糖酸內酯，輔酶NAD⁺則被還原為NADH。

細菌表面呈現系統是微生物表面呈現系統的一個重要分支，其基本策略也是將外源蛋白或多肽與細菌表面蛋白融合或嵌合并活性表達于細菌表面。自從發現大腸桿菌外膜蛋白LamB、OmpA和PhoE能夠作為外源蛋白的表面呈現載體以來，該技術得到了迅猛發展，現已成為研究的熱點，在微生物學、分子生物學、疫苗學等多個領域的基礎和應用研究中得到了廣泛應用。冰核蛋白(ice-nucleation?protein，INP))是丁香假單胞菌等菌株的外膜蛋白，可加速純水的冰晶形成。INP通過糖基磷脂酰肌醇而錨定在細菌表面，利于大分子蛋白的表面呈現。冰核蛋白細菌包括假單胞菌屬、歐文氏菌屬和黃單胞菌等。目前，利用全長的冰核蛋白、去掉中間重復序列的串連N端、C端結構域的蛋白或只用N端結構域的蛋白均在大腸桿菌表面成功展示了外源蛋白，例如：綠色熒光蛋白、幾丁質酶和磷酸鹽結合蛋白等。近年來，在Pseudomonas?borealis菌株中發現一種新的冰核蛋白基因inaPb，它與已熟知的冰核蛋白只有～66％的同源性。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于冰核蛋白的細菌表面展示系統及其在木糖檢測中的應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統：細菌表面展示系統為編碼目標蛋白木糖脫氫酶的基因序列xylB和負責跨膜定位和轉運的冰核蛋白N端結構域的基因序列inaPb-N。

編碼目標蛋白木糖脫氫酶的基因序列xylB和負責跨膜定位和轉運的冰核蛋白N端結構域的基因序列inaPb-N融合，表達于宿主細胞表面，得到基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統。

基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統的應用：所述細菌表面展示系統用于木糖的高特異性、高靈敏度檢測。所述細菌表面展示系統用于D-木糖的高特異性、高靈敏度檢測。

檢測原理是木糖在菌體表面的木糖脫氫酶的催化下，借助于輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)被氧化成木糖酸內酯，輔酶NAD⁺則被還原為還原態的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。NADH在340nm處有特征吸收峰，因此可以根據340nm處的吸光值來求得木糖的含量。

本發明的效果是：