[發明專利]一種測量小于衍射極限距離的光學成像方法

無效

• 申請號: 201210007115.4
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102538683A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 蓋宏偉;石星波
• 申請（專利權）人: 徐州師范大學
• 主分類號: G01B11/02
• 分類號: G01B11/02;G01N15/10;G01N21/25
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐惠芬

技術領域：

本發明涉及一種超高分辨率顯微成像的方法，特別是一種測量小于衍射極限距離的光學成像方法。

背景技術：

????遠場光學成像的分辨率受衍射極限限制，在可見光范圍內難以測量小于200nm的距離。提高光學影像的分辨率一直是遠場光學顯微成像的研究目標之一。能夠突破衍射極限的遠場光學成像方法被稱為遠場納米顯微技術。與近場掃描光學顯微鏡相比，遠場方法避免了實體探針對樣品的干擾，可以實現無損檢測及活細胞檢測。

????已經報道的單分子遠場納米成像的技術有如下三種：①利用熒光分子漂白時間的差異，分別確定檢測區內各分子的位置，可以實現8nm?的分辨率；②光激活定位顯微術（PALM）?法利用某些熒光分子經光激活后在檢測波長下發出熒光的性質，交替施加激活光和檢測光，大體控制分子發射熒光的順序；③超分辨隨機光重建顯微鏡（STORM）?以紅、綠兩種激光，可控、可逆地開關Cy3/Cy5?染料對中的Cy5?熒光，實現20-30nm?的成像分辨率。眾所周知，多波長的同時成像（即多色成像）在視覺效果、信息通量等方面均優于單波長成像。與發射單一波長熒光（簡稱：單色）的單分子納米成像原理相似，若能從時序上或空間上分別定位發射不同波長熒光（簡稱：多色）的分子，則可以實現多色單分子間小于衍射極限距離的測量。Nie利用單通道彩色CCD?和雙色熒光微球證實了這一方法的可行性，但是該方法的靈敏度尚有待提高，目前做不到單個納米顆粒和單個分子的水平。??

????現有超分辨顯微成像方法，大多儀器復雜，成本高，應用范圍有限，需要專業人員操作、分析。單分子和單個納米粒子水平上的多色超分辨成像尚未實現。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種測量小于衍射極限距離的光學成像方法，解決單分子和單個粒子水平上不能實現多色超分辨成像的問題，填補技術空白。

本發明的目的是這樣實現的：以顯微鏡為成像平臺，以成像檢測器為記錄儀，以有閃爍現象的衍射極限距離內的發光個體為測量對象，以光柵為識別手段，測量10－200納米距離內的發射不同波長的發光個體之間的距離；光柵對有閃爍現象的不同發光波長的發光個體進行光譜識別，分別超分辨定位；

所述發光個體是熒光分子，量子點，銀簇，碳點，發光納米顆粒；

所述的光柵是透射光柵、反射光柵；

所述發光波長在可見光范圍內即300－800納米；

基于光柵分光的超分辨定位，具體實施方案為：

（1）、構建標尺：選用發射波長不同的紅色與綠色量子點（QD）熒光標記物，分別與兩條互補的單鏈DNA連接，形成“單鏈DNA-量子點（ssDNA-QD）”交聯物；將兩種顏色的“單鏈DNA-量子點”交聯物混勻，雜交，形成“紅色量子點-DNA-綠色量子點（QD_red-DNA-QD_green）”復合物；DNA長度、量子點半徑已知，該標尺長度已知；

????（2）、成像裝置：?在成像檢測器前放置透射光柵，利用透射光柵分光原理，實現不同發射波長的熒光標記物的光譜成像；成像檢測器安置在顯微鏡上；

????（3）、超分辨定位：用成像裝置連續拍攝“紅色量子點-DNA-綠色量子點”樣品，當圖片中只有一個一級條紋時，表明此時只有一種顏色的量子點發光，則其零級光斑可用于此發光量子點的超分辨定位；同樣，當只出現另一條一級條紋時，另一種量子點亦可超分辨定位；這樣即可分別定位兩種量子點中心；

????（4）、漂移的校正：在進行分析的圖片上選取一單色發光點作為參考點，該參考點中心隨時間的變化即為平臺漂移，根據不同幀圖片中心的移動軌跡來校正光學平臺的漂移；然后計算量子點間的距離；

（5）、定位準確性：按照上述1-5步，測量三種不同長度DNA間的不同顏色量子點的距離；用三種不同距離與三種不同堿基對作圖，線性回歸計算堿基對的距離，考量定位的準確性；所述的三種不同長度分別為15個堿基對15bp；或者為30個堿基對30bp，或者為45個堿基對45bp。