[發明專利]一種磷脂酰肌醇的化學制備方法

無效

• 申請號: 201210006741.1
• 申請日: 2012-01-10
• 公開（公告）號: CN102964380A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 吳清平;李琳;張菊梅;蔡芷荷;郭偉鵬
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所;廣東環凱微生物科技有限公司
• 主分類號: C07F9/117
• 分類號: C07F9/117
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;余炳和

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種磷脂酰肌醇的化學溶液分離制備方法。

背景技術：

單核細胞增生李斯特菌(Listeria?monocytogenes，LM)為革蘭氏陽性無芽孢桿菌李斯特屬，是一種重要的人畜共患食源性病原菌，可以引起人和多種動物的胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產等，病死率高達30％～70％。由于其具有耐熱(60℃)、耐低溫(4℃)、耐鹽、耐干燥等特性，因此潛在危害很大，是食品安全風險評估所關注的重要食源性致病菌之一。1986年，WHO和FDA將其列為20世紀90年代食品四大致病菌之一；2000年，LM被WHO列為重點檢測的食源性致病菌之一；國際食品法典委員于2009年開始使用食品中LM的限量標準。第51屆世界衛生大會之后，我國開始逐步研究通過實施微生物學危險性評價(MRA)和危害性分析關鍵控制點(HACCP)等原理來加強對微生物性有害因素的有效管理。2009年JEMRA及美國FDA/FSIS分別對即食食品中LM進行定量評估并發布了評估報告。

近年來LM作為食品衛生及流行病學的研究熱點，其分離和鑒定方法取得了很大的進步。LM的檢測時間、特異性、靈敏度以及準確性等各方面都得到很大的改進。目前主要應用的方法有如下三類：傳統的培養方法、免疫學方法以及分子生物學檢測方法。

針對LM的快速檢測的需要，許多國家致力于LM顯色培養基的研究，針對LM特有的肌醇磷酸磷脂酶(PI-PLC)和β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glueosidase)設計顯色底物對LM進行快速檢測。商品化的顯色培養基主要有以下幾種：以七葉靈為底物的PALCAM、OXFORD、LPM、MOX培養基；以5-溴-4-氯-3-吲哚吡喃糖苷和肌醇磷酸X-IP為底物的BCMIII?listeria顯色培養基；以X-IP為底物的Rapid’LMONO?agar培養基；以5-溴-4-氯-3-吲哚吡喃糖苷和磷脂酰基醇為底物的CHROMagar?Listeria顯色培養基、ALOA培養基以及OCLA培養基。其中部分顯色培養基已經得到大規模的商品化。而國內關于LM顯色培養基的研究一直處于滯后狀態，主要是由于底物價格昂貴，難以大規模開發應用。因此LM顯色底物的制備研究成為制約LM顯色培養基應用的關鍵技術，是目前研究的難點。

國內外相關研究表明磷脂酰肌醇(l-α-phosphatidylinositol)能夠作用于LM中的特異性磷脂酶PI-PLC，可以作為特異性檢測底物應用于LM顯色培養基。

磷脂酰肌醇的主要分離制備方法有溶劑法、柱層析法、薄層色譜法、酶法和化學反應法等。其中溶劑法操作簡便，便于工業化，但是具有消耗溶劑量大，生產成本高的缺點；柱層析法分離效率高，但負載量小，可重復性差；薄層色譜制備量小，分離能力有限，主要用于檢測；化學反應方法合成容易使得肌醇磷脂中不飽和鍵著色且副產物難以有效分離；另外還有利用高效液相色譜制備少量磷脂酰肌醇純品，但是由于成本高操作復雜且產量很少，只停留在實驗室少量分析研究的階段。

目前國內的磷脂酰肌醇制備產率提高困難，難以商品化應用；國外引進又價格昂貴，從而限制了磷脂酰肌醇在微生物檢測等方面的應用，亟需尋找一種高產率且商品化可行的制備工藝。在國內大豆磷脂酰肌醇的研究比較少，迄今為止主要有齊齊哈爾大學以及武漢工程學院做過相關方面的研究。齊齊哈爾大學在2003年到2006年做了用溶劑法分離制備大豆肌醇磷脂相關方面的研究，其中2005年陳志強等報道了可以采用乙醇-正己烷體系分離了肌醇磷脂，2006年吳平等進一步考察了溶劑法分離磷脂酰肌醇的優化條件，并稱可以將產率提高到73.89％；2008年后武漢工業學院做了采用柱層析法分離制備大豆磷脂的研究，2008年以及2009年姜波等報道了用柱色譜法分離制備大豆磷脂，實驗表明硅膠為吸附介質分離大豆磷脂是可行的，但是由于柱層析法負載量較小，且分離周期長，所得產量較低而一直沒有得到實際應用。目前亟待開發一種簡便有效的分離方法，得到便于工業化的優化工藝條件，使磷脂酰肌醇的制備工業化，為其在顯色培養基中的應用創造條件。而國外相關研究集中在上世紀九十年代，目前已經發展到工業化應用領域。目前國外采用的獲得大豆肌醇磷脂的方法主要為酶法及分子改性等化學手段。

發明內容：

本發明的目的是提供一種磷脂酰肌醇的化學制備方法，該方法簡單易行，大大降低了生產成本，便于工業化生產。利用該方法制備得到的磷脂酰肌醇產品的純度高，經實驗證實可以作為進口原料的替代品作為底物應用到LM顯色培養基中，效果很好。