[發明專利]抑制水牛TREM1基因表達的shRNA、慢病毒表達載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201210006526.1
• 申請日: 2012-01-10
• 公開（公告）號: CN102517287A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 李湘萍;石德順;路新梅;李美青;喬樹葉
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N15/66;A61K48/00;A61P31/04
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明涉及水牛髓樣觸發受體1基因(TREM1)，尤其是一種抑制水牛TREM1基因表達的shRNA、慢病毒表達載體及其構建方法和應用。

背景技術

水牛是我國南方重要的農業生物資源，它具有適應性強、耐高溫高濕、易飼養、使用年限長和乳品營養價值高等特性，如今已成為極具開發價值的家畜品種。然而，水牛的低繁殖力、較高的疾病發生率卻嚴重制約了我國水牛產業的發展。其中，布氏桿菌病引起的母牛流產、不育在實際生產中極其常見，這不僅給畜牧業造成重大的經濟損失，而且嚴重威脅人類健康。長期以來，對布氏桿菌病的治療手段主要是使用抗菌素和疫苗，前者容易產生耐藥性，后者免疫效果不穩定、持續時間短。因此，如何有效控制布氏桿菌病仍是一項重大挑戰，亟需尋求一種新的防治途徑。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種抑制水牛TREM1基因表達的shRNA、慢病毒表達載體及其構建方法和應用。

為解決上述技術問題本發明采用如下技術方案：

抑制水牛TREM1基因表達的shRNA，該shRNA為shRNA-TREM194或shRNA-TREM294，它們都包含19nt的siRNA正義鏈，9nt的loop環，19nt的siRNA反義鏈和終止信號；

loop環的堿基序列為TTCAAGAGA；

終止信號的堿基序列為TTTTTTT；

shRNA-TREM194的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.3的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.4的堿基序列；

shRNA-TREM294的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.5的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.6的堿基序列。

上述抑制水牛TREM1基因表達的shRNA的慢病毒表達載體，該載體是：

pSicoR-GFP-shTREM-194或pSicoR-GFP-shTREM-294。

上述抑制水牛TREM1基因表達的shRNA的慢病毒表達載體的構建方法，該慢病毒表達載體由合成的shRNA-TREM194或shRNA-TREM294分別克隆入慢病毒表達載體pSicoR-GFP中而得。

上述抑制水牛TREM1基因表達的shRNA在抑制水牛TREM1基因表達方面的應用。

上述抑制水牛TREM1基因表達的shRNA的慢病毒表達載體在抑制水牛TREM1基因表達方面的應用。

上述抑制水牛TREM1基因表達的shRNA在制備防治水牛布氏桿菌病藥物方面的應用。

上述抑制水牛TREM1基因表達的shRNA的慢病毒表達載體在制備防治水牛布氏桿菌病藥物方面的應用。

發明人通過了解布氏桿菌病發生的分子機制，研究其信號轉導通路為其防治提供新的思路和方向。髓樣觸發受體1(TREM1)是專一表達于中性粒細胞、CD14單核/巨噬細胞等髓樣細胞表面的跨膜糖蛋白，由其介導的信號通路在炎癥反應和級聯放大中起重要作用，它還與Toll樣受體-4(TLR-4)在LPS所致炎癥反應中存在協同效應。因此，作為革蘭氏陰性菌脂多糖LPS誘導的免疫反應信號路徑中一個重要的靶基因，抑制TREM1基因的表達有可能改變一些其他相關因子的表達。

為此，發明人利用分子和細胞生物學技術，首先克隆得到水牛髓樣觸發受體1(TREM1)全長編碼區，構建了水牛TREM1基因融合蛋白表達載體，設計并構建水牛TREM1基因shRNA慢病毒表達載體；然后，采用脂質體轉染方法將水牛TREM1基因融合蛋白表達質粒和其shRNA慢病毒表達載體共轉入293細胞，收集細胞檢測水牛TREM1基因在293細胞中的表達，快速篩選獲得高效抑制水牛TREM1基因的shRNA干擾序列。本發明研究工作包括以下基本步驟：

<1>水牛TREM1基因的克隆、融合蛋白表達載體的構建及其表達檢測

克隆得到水牛TREM1基因mRNA的ORF全長序列，經過測序驗證序列正確后，將其定向插入pDsRed-N1載體中，構建水牛TREM1基因的融合蛋白表達載體，酶切驗證陽性重組質粒pDsRed-N1-TREM1；重組質粒pDsRed-N1-TREM1經脂質體轉染方法導入293細胞，細胞培養48h后，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況；收集細胞，采用RT-PCR方法檢測水牛TREM1基因在293細胞中的表達。