[發明專利]一種快速鑒定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法

無效

• 申請號: 201210006281.2
• 申請日: 2012-01-10
• 公開（公告）號: CN102517398A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 夏陽;燕麗萍;李雙云;劉翠蘭;束靖
• 申請（專利權）人: 山東省林業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

技術領域

本發明涉及一種快速鑒定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法，屬于生物學領域中分子生物學的檢測方法。

背景技術

鹽分是限制植物生長和產量的主要環境因素之一，土壤鹽漬化是一個世界性問題。植物耐鹽新品種的選育，一直是國內外研究的重點。絨毛白蠟(Fraxinus?Velutina?Torr.)為木犀科(Oleaceae)白蠟屬(Fraxinus?Linn.)落葉喬木，原產為美國，生長快，樹干通直，紋理美觀，抗逆，是鹽堿地造林、園林綠化和珍貴的用材樹種，是唯一的鹽堿地造林的大喬木樹種。但是，大多數絨毛白蠟不能夠在含鹽量超過0.3％以上的鹽堿地上正常生長和繁殖，其中山東省林業科學研究院劉德璽選育的魯蠟3號(Fraxinus?Velutina?Torr.Lula?3)品種，具有非常強的耐鹽能力，能夠在含鹽量0.5-0.6％條件下可以正常生長發育。該品種對沿海城市的綠化和美化、位于鹽堿地的油田地區的綠化、鹽堿地的土壤改良具有重要作用。

但從形態學鑒定耐鹽和鹽敏感植株非常困難，尤其是從耐鹽和鹽敏感植株雜交后代篩選出耐鹽個體，通常要進行生理測定和耐鹽試驗，耗時、費力且許多表型特征的不穩定性，而且可能破壞植株，另外形態特征測量和生理指標測定結果時常出現誤差。植物的耐鹽性狀是受多基因控制的，耐鹽植株和鹽敏感植株在基因組上存在一定的差異性。以PCR為基礎的分子生物學技術是快速檢測生物基因組差異的重要方法之一，直接以DNA形式出現，在植物體的各個組織、各發育時期均可檢測到，不受季節、環境因素的影響，且取材少，在苗期可以進行選擇，從而大大提高育種效率。然而，經檢索目前國內外尚無對絨毛白蠟植物耐鹽性狀分子快速檢測的相關報道。

發明內容

本發明的目的是對已有耐鹽品種雜交后代耐鹽鑒定方法中存在的費時、費力、成本高、準確性低的缺點，提供一種具有快速、簡便、成本低、靈敏度高的鑒定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法。

本發明所述的快速鑒定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法，步驟是：

(1)應用SEQ?ID?NO.1所示核酸序列為SCAR標記，以絨毛白蠟植物DNA為模板，利用所述SCAR標記的兩條引物在54～56℃的退火溫度下，進行PCR擴增，其中：所述SCAR標記的兩條引物分別是：

引物1：5’TGCTTGGTTTGTTCGTGG?3’；

引物2：5’CGTGCAACCTAAAGTTGAG?3’；

(2)將上述PCR擴增產物在1.0％瓊脂糖凝膠電泳上分離，觀測PCR結果；

(3)鑒定是否為耐鹽絨毛白蠟植株；如果PCR結果擴增出一條592bp的DNA條帶，判定為耐鹽植株；如果PCR結果擴增不出592bp的DNA條帶，判定為鹽敏感植株。

其中：

步驟(1)所述的PCR反應總體積優選為：25微升，2×Taq?PCR?MasterMix?12.5μl(天根生化科技有限公司)，引物1(10μmol/L)1μl，引物2(10μmol/L)1μl，20ng基因組DNA2μl，ddH₂O?8.5μl。

步驟(1)所述的PCR反應參數優選為：94℃預變性4min，94℃變性30s，55℃退火45s，72℃1.5min，循環30次，72℃延伸10min。

本發明采用RAPD技術，尋找與耐鹽堿性狀相關聯的RAPD分子標記，進一步轉化為穩定性、重復性強的SCAR標記，該SCAR標記是全長592bp的特異片段S20-592，其核酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。應用所述SCAR標記，以絨毛白蠟植物DNA為模板，采用簡單易操作的PCR擴增，即可利用分子標記快速檢測絨毛白蠟雜交后代的耐鹽植株與鹽敏感植株，為利用分子標記輔助選育和基因工程等手段改良絨毛白蠟耐鹽新品種提供了基礎，加速了絨毛白蠟耐鹽育種進程。為我國耐鹽堿林木種質的選育研究提供理論基礎和技術體系；豐富耐鹽堿綠化樹種的遺傳多樣性，扼制土地鹽漬化，提高土地生產力；增加生態、社會和經濟效益都具有現實而深遠的意義。

本發明提供的快速鑒定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法，具有靈敏度高，所需DNA用量少的特點，與常規形態學檢測、耐鹽試驗、生理指標測定相比，本發明的有益效果是：

1、簡便易行：在實驗室采用常規PCR技術對絨毛白蠟植株進行檢測，通過一次PCR擴增就可以判斷絨毛白蠟是否為耐鹽單株或耐鹽品種，在植株生長的任何時期都可以檢測。