[發明專利]一種從成熟紅麻葉片中提取DNA的方法

無效

• 申請號: 201210005996.6
• 申請日: 2012-01-11
• 公開（公告）號: CN102533729A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 徐建堂;祁建民;陶愛芬;方平平;林荔輝;林培清;陳濤;池仁漫
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于植物分子生物學領域，涉及一種紅麻DNA研究技術，更具體地涉及一種高質量、高產量的紅麻成熟葉片的DNA提取方法。

背景技術

紅麻(Kenaf)是錦葵科(Malvaceae)木槿屬（Hibiscus）一年生韌皮纖維作物，公元前4000年的非洲蘇丹就已栽培，紅麻作為天然纖維作物，具有生長速度快、抗逆性強、適應性廣等特點，巨大的生物產量為樹林的3-4倍，極強的二氧化碳吸收能力為森林的4-5倍，是發展低碳經濟的優勢作物。紅麻纖維除傳統上作為加工麻繩、麻袋、地毯等的原料外，還是加工汽車內飾、板材、麻碳等的良好材料，其纖維經變性可與棉花混紡為面料，具有吸濕、透氣、抑菌等生物功能。

隨著分子生物學的發展，通過提取植物DNA進行基因庫構建、基因克隆、遺傳轉化、分子標記等已在各種植物的研究中迅速展開。在這些技術的操作過程中，提取高質量DNA樣品是必要前提，能夠有效提取高質量DNA，一直是廣大生物技術工作者關心的問題。棉花、荔枝等植物含有大量的酚類物質及其次生代謝物質，在DNA提取過程中通常會受到這些次生代謝物質的干擾，影響DNA的質量和產量，因此對這類植物進行DNA分離時，其提取緩沖液和分離步驟應有相應的變化（王珍，方宣鈞，2003）、（郭安平，黃明等，1997）。

紅麻成熟葉片中含有多糖、多酚及其他次生代謝產物，這些次生物質在DNA提取過程中常與核酸形成復合物，形成粘稠的膠狀物質，并產生不同程度的褐化，對酶切、PCR擴增等操作產生不良影響，從而不能用于分子生物學研究。而成熟紅麻葉片含有較多多糖、多酚及其他次生代謝產物，加大了DNA提取的難度。另外，紅麻雖是自花授粉作物，但在繁種生產中常出現自然雜交株，難以保持品種的特性和純度（何凡，1989）。因此，為確保所提取的紅麻DNA純度，必須根據紅麻生長期內純合的植株葉片為材料，而不是幼苗期的葉片。目前，有關紅麻基因組DNA提取方法的報道較少，且均以幼嫩、新鮮葉片為試材（徐建堂等，2007；郭安平等，1997），對成熟、干燥葉片的DNA進行提取的研究雖也有報道（曹德菊，1999；白鳳虎，2007），但由于步驟操作復雜，嚴重影響了紅麻DNA的提取效率。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種高效、穩定地從成熟紅麻葉片中提取DNA的方法。

本發明的目的通過如下技術方案實現：

稱取紅麻成熟葉片1.0g，用液氮迅速研磨至粉末狀，將粉末裝入10ml離心管中，管中加入3ml?65℃預熱的重量比為4%CTAB?提取緩沖液，重量比為3%抗氧化劑β-巰基乙醇；然后冷卻至室溫，加入等體積的氯仿與異戊醇混合液，混合液中氯仿/異戊醇按體積比為24/1，輕柔顛倒混勻10min；1200rpm?離心10min；吸取上清液轉入10ml離心管中，依次加入1/3體積的3?mol/L?NaAc溶液及等體積-20℃預冷的無水乙醇，混勻，冰上沉淀30min；于1200rpm?離心10min；將沉淀移入1.5ml離心管中，用75%無水乙醇漂洗3min，重復1次；將沉淀真空抽干或于室溫下吹干，加入100μl?TE?溶解沉淀，進行DNA純化或放入-20℃冰箱保存備用。所提取的DNA條帶清晰，用于分子標記研究，或紅麻葉綠體DNA和線粒體DNA的擴增研究。

本發明的顯著優點：

紅麻成熟葉片中富含多糖、色素、酚類等次生代謝物質，這些物質極易引起紅麻DNA褐化、降解，嚴重影響了后續的PCR擴增及條帶亮度。本發明操作步驟簡單，節省了DNA提取時間，在磨樣后于提取液中加入了3%?β-巰基乙醇，可有效防止紅麻樣品的色素、酚類和醌類等次生代謝物質的氧化干擾，同時在第一次離心后得到的上清液加入1/3體積的3?mol/L?NaAc（pH4.8），有利于變性的紅麻DNA凝聚而沉淀，提高了紅麻基因組DNA的產量。本發明優化的紅麻成熟葉片DNA提取方法重復性好、實驗結果較穩定、瓊脂糖電泳條帶清晰。本發明操作步驟簡單，節省了DNA提取時間，從而有效防止DNA氧化而造成的損失，提高DNA的提取產量，本發明為進一步開展紅麻及其麻類的基因組學的研究奠定工作基礎。

附圖說明

圖1?兩種方法獲得的紅麻DNA?的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖；1-8?泳道:?SDS法獲得的紅麻福紅952?DNA；9-18泳道CTAB法獲得紅麻福紅952?DNA。