[發明專利]一種間日瘧紅內期疫苗及其制備方法

無效

• 申請號: 201210005603.1
• 申請日: 2012-01-10
• 公開（公告）號: CN102533678A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 單茜茜;陳劍清;舒特俊;張耀洲
• 申請（專利權）人: 特菲（天津）生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/30;C12N15/866;C07K14/445;C07K16/20;A61K39/015;A61P33/06;G01N33/569;C12R1/93
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張艷贊

1.一種家蠶重組桿狀病毒Bmgp64-PvMSP4，該病毒保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.5605。

2.一種權利要求1所述的重組桿狀病毒Bmgp64-PvMSP4的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)?PvMSP4基因的獲得：根據NCBI上基因登錄號為GQ912373.1的PvMSP4基因序列設計兩對引物，所述PvMSP4基因序列由中間的一個內含子將其分成外顯子1和外顯子2，利用外顯子1的下游引物和外顯子2的上游引物引入相同的BamH?I酶切位點，基因序列由GGTAGC轉變成GGATCC，但是編碼的氨基酸序列不變；以間日瘧原蟲Tv159病毒株的基因組DNA為模板，通過PCR擴增兩段基因后分別進行雙酶切，并用連接酶連接后作為模板，利用外顯子1的上游引物和外顯子2的下游引物PCR擴增獲得基因PvMSP4，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：8所示；

(2)重組供體質粒pFastBacI-gp64-PvMSP4的構建：將步驟(1)?經PCR所得完整的PvMSP4基因插入桿狀病毒表面展示載體pFastBacI-gp64中，轉化大腸桿菌?TG1感受態細胞，挑斑提取重組供體質粒pFastBacI-gp64-PvMSP4，并用PCR和雙酶切進行鑒定；

(3)重組桿狀病毒Bmgp64-PvMSP4的獲得與鑒定：將步驟(2)?鑒定成功的重組供體質粒pFastBacI-gp64-PvMSP4轉化大腸桿菌DH10Bac感受態細胞，通過轉座方式進行藍白斑篩選，抽提重組桿狀病毒基因組，并用M13通用引物PCR?進行鑒定；將鑒定成功的重組桿狀病毒基因組通過脂質體介導法轉染家蠶BmN?細胞，待細胞發病后收集第一代重組病毒懸液0-4℃保存，提取病毒基因組并用M13通用引物進行PCR鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64-PvMSP4。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中外顯子1的上游引物含EcoR?I，外顯子2的下游引物含Xho?I；且外顯子1、外顯子2、外顯子1的上游引物、外顯子1的下游引物、外顯子2的上游引物、外顯子2的下游引物的序列分別如SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6所示。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中桿狀病毒表面展示載體pFastBacI-gp64由PCR擴增得到的桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列、桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列克隆至轉移載體pFastBacI中獲得。

5.一種權利要求1所述的重組桿狀病毒Bmgp64-PvMSP4表達的蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：11所示。

6.一種權利要求5所述蛋白的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)將權利要求1所述的重組桿狀病毒Bmgp64-PvMSP4感染家蠶BmN細胞進行病毒擴增；

(2)針刺接種法接入家蠶五齡幼蟲和蠶蛹；

(3)收集表達的權利5所述蛋白。

7.一種權利要求1所述家蠶重組桿狀病毒BmNPV-gp64-PvMSP4在間日瘧紅內期疫苗制備中的應用。

8.一種權利要求5所述蛋白在間日瘧紅內期疫苗制備中的應用。