[發(fā)明專利]一種重組人巨細(xì)胞病毒蛋白及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210004913.1
• 申請(qǐng)日: 2012-01-10
• 公開（公告）號(hào): CN102533795A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳廷友;王志新;王健;張曉剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 英諾特（唐山）生物技術(shù)有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C12N15/38
• 分類號(hào): C12N15/38;C12N15/70;C07K14/045;C12N1/21;G01N33/68;G01N33/569;C12R1/19
• 代理公司: 北京君智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11305
• 代理人: 呂世靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程、疫苗研制和診斷試劑等領(lǐng)域，具體地涉及一種人巨細(xì)胞病毒蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

人巨細(xì)胞病毒(Human?Cytomegalovirus，簡(jiǎn)稱HCMV)屬皰疹病毒β亞科，是一種DNA病毒，其感染在人群中廣泛存在，我國(guó)人群中HCMV感染相當(dāng)嚴(yán)重。婦女在妊娠初期受HCMV原發(fā)感染是引起胎兒宮內(nèi)感染和發(fā)育缺損的重要原因，在孕期原發(fā)性感染HCMV的胎兒和新生兒中，80％可導(dǎo)致智力低下、畸形和死亡[Middeldorp?JM.Jongsma?J，Haar?AT，et?al.Detection?of?immunoglobulin?M?and?G?antibodies?against?cytomegalovirus?early?and?late?antigend?by?enzyme-linked?immunosorbent?assay.J?Clin.Microbiol，1984；20(4)：763-771.]。HCMV也是器官移植失敗和艾滋病病人并發(fā)感染死亡的主要原因之一。對(duì)非免疫缺陷者常導(dǎo)致長(zhǎng)期隱性感染，甚至引起感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、畸變或癌變等[Huang?ES.The?pathogenicity?of?Human?Cytomegalovirus.Springer-Vellag.Berin，1993，1-45]。因此快速準(zhǔn)確的診斷HCMV病毒感染具有十分重要的意義。

目前巨細(xì)胞病毒感染診斷方法有脫落細(xì)胞及組織病理檢查、病毒分離、分子雜交試驗(yàn)和血清學(xué)檢查，但由于前三種方法技術(shù)設(shè)備要求高，檢測(cè)周期長(zhǎng)的局限性，無(wú)法廣泛使用，而血清學(xué)檢查具有簡(jiǎn)便快速的特性使其在臨床上得到廣泛應(yīng)用，目前大多檢測(cè)試劑采用盒用的HCMV蛋白質(zhì)抗原主要是來(lái)源于病毒培養(yǎng)物或是重組表達(dá)的單一蛋白片段，或者由于蛋白質(zhì)抗原純度低及特異性差，造成假陽(yáng)性而降低檢測(cè)特異性；或者由于單一片段抗原蛋白所含抗原決定簇較少，所識(shí)別的抗體相應(yīng)較少，易造成假陰性而降低檢測(cè)敏感性，雖然多種單一片段組合制備檢測(cè)試劑也可以避免上述問題，但必然要求多次進(jìn)行提取純化過程，而且小分子蛋白質(zhì)或多肽的提純技術(shù)要求更高，工作效率太低。

另外，在全球范圍內(nèi)，目前缺乏有效治療病毒感染藥物的情況下，通過接種疫苗預(yù)防病毒感染成為一種重要的醫(yī)學(xué)干預(yù)手段，HCMV疫苗的研制也是進(jìn)行HCMV研究的重要領(lǐng)域之一，而疫苗研究的一個(gè)重要前提是其所用蛋白質(zhì)抗原應(yīng)具有高特異性、強(qiáng)免疫原性和盡量完整的抗原決定簇，因此開發(fā)一種多抗原決定簇串聯(lián)的重組蛋白質(zhì)技術(shù)是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容

(一)要解決的技術(shù)問題

本發(fā)明的目的是提供一種重組人巨細(xì)胞病毒蛋白，本發(fā)明的另一目的是提供該重組人巨細(xì)胞病毒蛋白在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

(二)本發(fā)明的技術(shù)方案

本發(fā)明提供了一種編碼人巨細(xì)胞病毒蛋白的重組DNA，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。同時(shí)提供了由該重組DNA序列編碼的人巨細(xì)胞病毒蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

本發(fā)明還提供了一種人巨細(xì)胞病毒蛋白的表達(dá)載體pET-28a-HCMV，它是將SEQ?ID?NO：1所示所述的重組DNA序列插入到質(zhì)粒pET-28a上得到的重組質(zhì)粒，其質(zhì)粒圖譜如附圖2所示。將表達(dá)載體pET-28a-HCMV導(dǎo)入大腸桿菌中，得到表達(dá)人巨細(xì)胞病毒蛋白的工程菌株。

本發(fā)明利用SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列通過基因工程方法制備人巨細(xì)胞病毒蛋白可以通過如下步驟實(shí)現(xiàn)：

1)獲得具有SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列；

2)將該核苷酸序列導(dǎo)入質(zhì)粒，優(yōu)選pET-28a質(zhì)粒；

3)將該質(zhì)粒導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌宿主細(xì)胞，更優(yōu)選BL21(DE3)菌株中；

4)在有利于所述核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；

5)回收、純化及復(fù)性所表達(dá)的重組蛋白。

本發(fā)明提供的檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒感染的試劑盒，其組分中的抗原是本發(fā)明所述的重組人單純皰疹病毒蛋白。用于標(biāo)記人巨細(xì)胞病毒蛋白的標(biāo)記物選白自制膠體金、辣根過氧化物酶(HRP)。

本發(fā)明所述的采用膠體金標(biāo)記抗原的試劑盒中，抗人IgG抗體劃線包被濃度為2.0mg/ml，HCMV抗原膠體金復(fù)合物在濃縮原液到稀釋一倍之間包被載金墊。抗人IgG抗體劃線量為1.0μl/cm，膠體金結(jié)合物噴點(diǎn)量為25.0μl/cm。兔抗巨細(xì)胞病毒抗體包被量為1.0μl/cm，包被濃度為5.0mg/ml。