[發明專利]側孢短芽孢桿菌抗菌肽及其在抑制病原真菌和細菌生長中的應用

無效

• 申請號: 201210004727.8
• 申請日: 2012-01-09
• 公開（公告）號: CN102786581A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 邱德文;郭立華;曾洪梅;楊秀芬;袁京京;趙璟
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;A01N43/36;A01P1/00;A01P3/00
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 盧新;解政文

技術領域

本發明涉及一種含有不多于15個氨基酸的端部具有修飾的肽段。

背景技術

抗菌肽是一類具有抗菌活性的小分子多肽，廣泛存在于生物體內，具有分子量小、生物活性穩定、作用機制獨特、不易產生耐藥性等特點，對病原真菌與細菌具有強烈的抑制及殺滅作用。申請人從側孢短芽孢桿菌中挖掘新結構的抗菌肽，不僅可以提供寶貴的抗菌資源，而且為側孢短芽孢桿菌的開發利用開辟了新的途徑。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種能抑制病原真菌和細菌生長的側孢短芽孢桿菌(Brevibacillus?laterosporus)抗菌肽及其應用。

本發明所述的側孢短芽孢桿菌(Brevibacillus?laterosporus)A60菌株已經于2012年1月9日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行了保藏，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101，登記入冊編號CGMCC?No：5694，分類命名為：側孢短芽孢桿菌(Brevibacillus?laterosporus)。

一種側孢短芽孢抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，其中，該氨基酸序列的N端上還連接有-(CH₂)₃N(CH₃)₂，該氨基酸序列的C端上連接有細交鏈孢菌酮酸衍生物，該細交鏈孢菌酮酸衍生物的結構式如下所示：

本發明還涉及該側孢短芽孢桿菌抗菌肽在抑制病原真菌生長中的應用。

本發明側孢短芽孢桿菌抗菌肽在抑制病原真菌生長中的應用，其中所述病原真菌為辣椒疫霉菌(Phytophthora?capsici)、西瓜枯萎病菌(Fusarium?oxysporum?f.sp.niveum)、小麥赤霉病菌(Fusarium?graminearum)、灰葡萄孢菌(Botrytis?cinerea)和草莓炭疽病菌(Colletotrichum?fragariae)。

本發明還涉及該側孢短芽孢桿菌抗菌肽在抑制細菌生長中的應用。

本發明側孢短芽孢桿菌抗菌肽在抑制細菌生長中的應用，其中所述細菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)、番茄瘡痂病菌(XanthomonasCampestrispv.Vesicatoria)、普通變形桿菌(Prototheca?wickerhamii.)和巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)。

本發明側孢短芽孢抗菌肽的制備過程包括以下步驟：

1、側孢短芽孢桿菌A60培養及發酵代謝液制備

挑取活化單菌落于LB培養基中培養，培養條件為28℃、180rpm培養大于48h，離心去除菌體細胞，上清液用于抗菌肽分離；

2、抗菌代謝物的提取

(1)80％硫酸銨沉淀

對所得上清液進行硫酸銨沉淀，使硫酸銨達到80％飽和度，4℃過夜，離心收集沉淀，透析除鹽得到側孢短芽孢桿菌粗提物；

(2)離子交換層析分離：

用陽離子交換層析分離側孢短芽孢桿菌粗提物，層析柱為HiTrap?SP?HP陽離子柱(GE)，平衡液為20mM的MES(pH6.2)，洗脫液為20mM的MES(pH6.2)與1M?NaCl，流速2.5ml/min。線性洗脫，收集第二洗脫峰組分；

(3)薄層層析分離

用薄層硅膠層析板對第二洗脫峰進行薄層層析，展開劑為異丙醇∶正丁醇∶氨水∶水，其體積比例為60∶20∶10∶20，展開時間約2小時，獲得4個組分；

(4)反相層析純化

收集薄層層析中離溶劑前沿最近的組分，將其用乙腈溶解，進行反相層析，反相層析的具體條件如下：柱子采用Waters?Atlantis?T3-C18柱，直徑2.1mm、柱長150mm、粒徑3.5μm，進樣體積為200ul，平衡緩沖液為含有1％三氟乙酸的超純水，洗脫緩沖液為100％乙腈，收集第13-14.5分鐘洗脫的組分；

(5)二次反相層析純化

將步驟(4)收集的組分再次進行反相層析，層析具體條件同步驟(4)，收集第14-14.5分鐘洗脫的組分，即得。