[發明專利]小鼠醛氧化酶轉錄水平定量用PCR引物組合及PCR方法

無效

• 申請號: 201210004660.8
• 申請日: 2012-01-10
• 公開（公告）號: CN102690882A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 張才;王臣;汪紀倉;楊自軍;王雪瑩;朱重偉;王亞壘;尚澤松
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/26;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

技術領域

本發明涉及一種小鼠含鉬酶醛氧化酶轉錄水平進行定量用PCR引物組合，同時還涉及一種使用該引物的實時熒光定量PCR方法，屬于生物檢測技術。

背景技術

醛氧化酶(aldehyde?oxldases.AOX)是一類催化醛類氧化成相應的羧酸并釋放出活性氧的蛋白酶，主要存在于肝臟和紅血球中。它屬于鉬-黃素酶(molybdo.flavorenzyme.MFE)家族的亞家族，是新陳代謝不可缺少的酶類。它參與多種生理調節，可以將體內形成的有毒醛氧化為無毒酸，以緩解醛類對機體的毒害作用，也參與細胞內電子傳遞，在與代謝和繁殖相關的生理活動中起著非常重要的作用。其轉錄水平的高低反映了機體代謝的狀態。

以往的對醛氧化酶的研究主要集中在該酶的序列、結構和功能上，其中RalfR.Mendel在Biochimica?et?Biophysica?Acta?1763(2006)621-635發表論文Cell?biology?of?molybdenum就醛氧化酶的結構和功能等做了綜述，而對于醛氧化酶轉錄水平研究上缺乏有效的工具。

而實時熒光定量PCR的基因擴增法已被廣泛應用于基因轉錄水平的定量。實時熒光定量PCR可以對極微量的DNA模板進行準確定量，因其精度高，時間短而被廣泛的應用。目前國內外還未見對醛氧化酶轉錄水平定量方法的研究。

為了研究小鼠體內醛氧化酶的轉錄水平，需要建立一種能夠精確對醛氧化酶mRNA定量的方法，進而為研究醛氧化酶功能及其影響因素打下基礎。

發明內容

本發明的目的提供了一種醛氧化酶轉錄水平定量用PCR引物組合在轉錄水平上對醛氧化酶進行定量。

同時，本發明的目的還在于提供了一種能夠實時熒光定量的PCR方法。

為了實現上述目的，本發明的技術方案采用了一種小鼠醛氧化酶轉錄水平定量PCR引物，其核苷酸序列為：

正向：5’-ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3’

反向：5’-TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC-3’。

本發明的技術方案還采用了一種醛氧化酶轉錄水平定量實時熒光定量PCR方法，該方法以樣品總RNA反轉錄成的cDNA為模板，利用引物組合進行實時熒光定量PCR擴增，根據反應體系中熒光的變化情況定量醛氧化酶轉錄水平。

擴增序列為：actgcgtgggccatcttgtctgtgctgtgattgcagattctgagacacgggcaaagcaagcggcgaagcaagtgaaggtggtctaccaagacttggcgcctctgatcctaacgattgaggaagctatacaacacaagtccttcttcaagtcagaacggaagctggagtgtgggaatgttgacgaagcatttaaaatcgttgatcaaattcttgaaggtgaaatacacataggcggccagga。

所述的實時熒光定量PCR擴增體系為：25μL體系2×SYBR?Mix?12.5μL，10μmol/L正向；反向引物各0.5μL，cDNA模板2μL，9.35μL去離子水，TaqDNAPolymerase?0.15μL，三步法對樣品進行擴增，在熒光定量PCR儀上獲取CT值。

所述的三步法為95℃3min，95℃30sec，60℃30sec，72℃31sec，40個循環。

本發明通過分析小鼠醛氧化酶基因序列，設計特異引物，能夠快速、精確的對醛氧化酶轉錄水平定量。本發明的引物可以通過利用本領域技術人員公知的化學合成方法來進行的DNA合成技術來獲得。引物序列是在充分分析醛氧化酶基因序列的基礎上，因此對材料中非目的基因沒有擴增信號。通過使用本發明的引物，對小鼠的醛氧化酶轉錄水平實施定量，方法簡單，精確。并且，本發明的引物特異性強，不會受到其他基因的干擾，為研究小鼠醛氧化酶功能以及其他因素對其影響提供了有效工具。

實時熒光定量PCR25μL體系(2×SYBR?Mix?12.5μL，10μmol/L正向、反向引物各0.5μL，cDNA模板2μL，9.35μL去離子水，TaqDNA?Polymerase?0.15μL)，三步法(95℃3min，95℃30sec，60℃30sec，72℃31sec，40個循環)對樣品進行擴增，在熒光定量PCR儀上獲取CT值。擴增結果可以通過與看家基因(如3-磷酸甘油醛脫氫酶基因等)比較，從而確定醛氧化酶的轉錄水平。計算公式如下：

醛氧化酶基因轉錄水平＝2^-ΔCT