[發明專利]一種水產養殖生物和養殖環境中抗生素抗性菌株的鑒定方法

無效

• 申請號: 201210004542.7
• 申請日: 2012-01-09
• 公開（公告）號: CN102534002A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 黃志堅;陳旭凌;何建國
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及一種水產養殖生物和養殖環境中抗生素抗性菌株的鑒定方法。

背景技術

近年來由于抗生素在養殖業和畜牧業中的大量使用，導致其對環境污染的問題日趨嚴重，已成為當前國際上的研究熱點之一。我國是世界第一水產養殖大國，但近年來由于水產養殖污染加劇，造成養殖環境質量不斷惡化，病原生物種類增多和傳播速度加快，養殖病害日趨嚴重，水產養殖中的病害問題特別是細菌性病害在密集型養殖系統中發生頻繁且影響嚴重，這極大地限制了我國水產養殖業的發展。目前病害防治的主要方法是使用抗生素類藥物，抗生素作為飼料添加劑在動物養殖業中使用非常普遍。抗生素的長期濫用很可能會誘導動物體內產生抗生素抗性基因（Antibiotics?resistance?genes,?ARGs），ARGs經排泄后將對養殖區域及其周邊環境造成潛在基因污染。隨著抗生素類藥物不斷的大量使用，許多細菌都有了耐藥性，且情況日益嚴重，抗生素抗性基因已經成為一種新型的環境污染物。目前在不同的環境介質如水體沉積物水生生物和細菌體內等均已檢出?ARGs的存在，并且有研究還發現ARGs能夠通過可移動的遺傳元件（Genetic?mobile?elements）在細菌之間傳播，進而在環境中擴散，這將會對公共健康和食品安全構成嚴重的威脅。針對水產養殖業大量使用抗生素這一現狀，開展漁業環境抗生素抗性基因污染的研究，建立水產養殖生物和養殖環境抗生素抗性菌株篩選和鑒定方法，揭示抗生素抗性基因在漁業環境中的擴散和傳播規律，對于評價抗生素抗性基因的生態風險十分必要。不僅能確保我國水產養殖業的健康可持續發展，而且對于我國的生態安全和經濟發展具有重要的現實意義。

目前，人們普遍認為抗生素對環境微生物的耐藥性的選擇和誘導可能是其環境效應最重要的部分?？股貙δ退幘昕剐曰駻RGs的誘導具專一性，因此可以認為抗生素本身在環境中的遷移、轉化及歸趨等環境行為與其所誘導的抗生素抗性基因在環境中的廣泛傳播在理論上應該具有很大的相似性和一致性。己有一些研究證實了抗性基因的存在與抗生素的使用之間存在很好的相關性。研究表明，攜帶ARGS的微生物菌株死亡后，攜帶ARGS的DNA可釋放到環境中并持久存在，原因是在脫氧核糖核酸酶的保護下，防止其被降解，裸露的DNA分子最終又可以轉入到其他細胞內?？股乜剐曰虻姆肿訖z出可以確定無疑地證明細菌的耐藥性，闡釋細菌耐藥機理，更可以檢查耐藥因子的起源及傳播擴散途徑和動態，為耐藥細菌，尤其是耐藥病原菌的追蹤監測提供了其它方法無法取代的最佳手段。利用現代分子生物學技術測定耐藥基因的核酸序列還可用來檢測耐藥基因的變異，用來追蹤某一耐藥基因的系統發生和進化演化，并通過計算機分子結構建模而預測該耐藥基因表達產物耐藥譜的演化。目前的抗性基因檢測方法主要有兩種，傳統的方法是利用抗性平板法篩選出抗性細菌，對其進行總量的測定，并鑒定出抗性細菌的種屬，然后從菌體中提取?DNA，再利用聚合酶鏈式反應（PCR）檢測環境中的抗性基因。由于環境中許多微生物難以平板培養，主要是因為對其最適生長溫度、pH、氧、營養成分等不十分清楚。因此，以傳統微生物培養的方法評價抗性難免低估了微生物的種類。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術中的上述不足，提供一種直接在水產養殖生物或環境樣品中提取總DNA，再利用?PCR方法分析抗性菌株的方法，即一種水產養殖生物或水產養殖環境中抗生素抗性菌株的鑒定方法。

本發明通過以下技術方案實現上述目的：

一種水產養殖生物或水產養殖環境中抗生素抗性菌株的鑒定方法，步驟如下：

（1）?細菌總DNA的提?。禾崛∷a養殖生物或水產養殖環境樣品里細菌總DNA；

（2）?以步驟（1）所得總DNA為模板，SEQ?ID?NO:1~2所示序列為引物，?PCR擴增和分析16S?rDNA序列，進行測序，鑒定菌株的種屬名稱；

（3）經過種屬鑒定的菌株進一步測序鑒定，檢測帶有抗生素抗性基因的菌株，所述抗生素抗性基因為耐氯霉素基因floR、耐磺胺類基因sul1，和/或耐磺胺類基因sul2（三種耐藥基因均為北京六合華大基因科技股份有限公司深圳分公司產品）。

上游引物27f有19個堿基：AGA?GTT?GAT?CCT?GGC?TCA?G（SEQ?ID?NO:1），下游引物1492r有19個堿基：GGT?TAC?CTT?GTT?ACG?ACT?T（SEQ?ID?NO:2）。