[發明專利]抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201210004296.5
• 申請日: 2012-01-06
• 公開（公告）號: CN102512694A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 陳金頂;李銀光;趙明秋;徐艷芳;劉文俊;代曼曼
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K31/713;A61K39/235;A61K35/76;C12N15/113;C12N15/861;C12N7/01;A61P31/14
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 楊曉松;裘暉

1.一種抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑，其特征在于：包括siRNA-VP1和siRNA-2B；所述的siRNA-VP1的轉錄模板的正義鏈的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述的siRNA-VP1的轉錄模板的反義鏈的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；所述的siRNA-2B的轉錄模板的正義鏈的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；所述的siRNA-2B的轉錄模板的反義鏈的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

2.根據權利要求1所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑，其特征在于：所述的siRNA-VP1和siRNA-2B是將其轉錄模板分別與U6啟動子連接，克隆入載體制備得到。

3.根據權利要求2所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑，其特征在于：所述的載體為人復制缺陷型5型腺病毒質粒載體pAdeno-X。

4.根據權利要求3所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑，其特征在于：所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑為重組腺病毒Adeno-2B-VP1；

所述的重組腺病毒Adeno-2B-VP1通過如下方法制備得到：是將siRNA-VP1的轉錄模板和siRNA-2B的轉錄模板分別與U6啟動子連接，克隆入人復制缺陷型5型腺病毒質粒載體pAdeno-X，得到能分別轉錄、串聯結構的質粒；接著通過包裝細胞包裝，得到該重組腺病毒Adeno-2B-VP1。

5.權利要求1所述的抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑的制備方法，其特征在于包含以下步驟：

(1)將如下所示的siRNA-VP1的轉錄模板和siRNA-2B的轉錄模板分別克隆入PSIREN-shuttle穿梭載體，得到重組質粒pShuttle-2B和pShuttle-VP1；

siRNA-VP1的轉錄模板的核苷酸序列如下所示：

正義鏈為：

5’-GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAGAG-3’；

反義鏈為：

5’-AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCG-3’；

siRNA-2B的轉錄模板的核苷酸序列如下所示：

正義鏈為：

5’-GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGAG-3’；

反義鏈為：

5’-AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG-3；

正義鏈寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位點粘性末端，反義鏈寡核苷酸的5’端突出部分是EcoRI酶切位點粘性末端，加粗部分為siRNA正義鏈，斜體部分為siRNA的反向互補鏈，小寫字體為loop環序列，下劃線部分為7個連續T終止信號及其互補序列；

(2)分別通過PI-Sce?I/I-Ceu?I雙酶切重組質粒pShuttle-2B和pShuttle-VP1，得到目的片段；再通過體外連接法分別將目的片段與人復制缺陷型5型腺病毒質粒載體pAdeno-X連接，得到重組質粒pAdeno-2B和pAdeno-VP1；

(3)將重組質粒pAdeno-2B和pAdeno-VP1分別線性化后，通過包裝細胞包裝，得到重組腺病毒r?Adeno-2B和rAdeno-VP1；該重組腺病毒Adeno-2B和Adeno-VP1即為抗口蹄疫病毒復制與感染的生物制劑。