[發(fā)明專利]分泌抗番茄黃化曲葉病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210004197.7
• 申請(qǐng)日: 2012-01-09
• 公開（公告）號(hào): CN102559603A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周雪平;吳建祥;劉歡;謝艷;尚海麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/20
• 分類號(hào): C12N5/20;C07K16/08;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分泌抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。

背景技術(shù)

番茄是全球重要的蔬菜作物，它品種多，適應(yīng)性廣，營(yíng)養(yǎng)豐富，是全世界總產(chǎn)量最高的30?種農(nóng)作物之一。雙生病毒對(duì)番茄的危害是番茄生產(chǎn)的重要制約因素之一，尤其是近幾十年來雙生病毒病在全球范圍的擴(kuò)展蔓延導(dǎo)致其在番茄上的危害日趨嚴(yán)重。在所有侵染番茄的雙生病毒中，番茄黃化曲葉病毒（Tomato?yellow?leaf?curl?virus，TYLCV）危害最為嚴(yán)重。TYLCV最早于1964?年在以色列被發(fā)現(xiàn)并正式命名，之后的30?年間該病害迅速擴(kuò)散到中東、地中海沿岸、東南亞地區(qū)、美國、日本、澳大利亞、印度、墨西哥等眾多國家和地區(qū)。20?世紀(jì)90?年代中期，隨著雙生病毒的傳毒介體—B?型煙粉虱入侵我國，導(dǎo)致煙粉虱傳番茄雙生病毒在我國由東向西、由南向北急速蔓延，嚴(yán)重威脅我國產(chǎn)值近千億元的番茄產(chǎn)業(yè)。2005?年秋，TYLCV首次在廣西番茄主產(chǎn)區(qū)百色市田陽鎮(zhèn)大面積爆發(fā)，?2006?年在上海、江蘇和浙江等地相繼被發(fā)現(xiàn)，之后迅速擴(kuò)展至安徽、山東、河南、河北、廣東、重慶、云南、福建、遼寧和北京等地。目前全國已有15?個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）發(fā)現(xiàn)該病毒的危害現(xiàn)象，已造成嚴(yán)重?fù)p失的地區(qū)有浙江、江蘇、安徽、山東、河南和河北等省。番茄黃化曲葉病由番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）引起，該病毒隸屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），具有典型的雙生病毒孿生顆粒形態(tài)，病毒粒子的大小約為20×30?nm。其基因組結(jié)構(gòu)組成因不同分離物而分為單組份或雙組份。病毒鏈上的AV1基因編碼病毒的外殼蛋白（Coat?protein，CP），與病毒粒子的包裝、介體傳毒、系統(tǒng)侵染及與寄主的互作相關(guān)。感染TYLCV的植株發(fā)病癥狀與病毒分離物、寄主的遺傳背景、生長(zhǎng)階段以及環(huán)境條件有關(guān)，癥狀的表現(xiàn)會(huì)有所差異。發(fā)病植株的典型癥狀為頂部葉片變小、皺縮卷曲黃化，節(jié)間縮短，植株明顯矮化，開花延遲，花朵減少，坐果少而小，成熟期果實(shí)不能正常轉(zhuǎn)色，且成熟不均勻。該病在番茄生長(zhǎng)各階段均可發(fā)生。若在開花前感病，果實(shí)產(chǎn)量和商品價(jià)值均大幅度下降，嚴(yán)重時(shí)造成的損失可達(dá)100?%。番茄黃化曲葉病毒主要通過B?型煙粉虱傳播，煙粉虱獲毒后可終生傳毒，但不經(jīng)卵傳，研究表明嫁接也可導(dǎo)致病毒的傳播，但不能經(jīng)機(jī)械摩擦或種子傳毒。TYLCV寄主很廣，據(jù)報(bào)道能夠侵染包括栽培作物以及雜草在內(nèi)的12?個(gè)科的30?多種植物，一些無癥帶毒的雜草和野生植物往往成為下茬番茄作物的侵染源，同時(shí)傳播介體煙粉虱也具有很廣的寄主范圍。加上各地區(qū)氣候條件、品種和栽培方式有所不同，單憑一種方法很難達(dá)到有效防治效果，因而對(duì)TYLCV的防治應(yīng)采用因地制宜的綜合防治措施，為此建立一套靈敏、快速的病毒檢測(cè)方法對(duì)該病毒的監(jiān)控和防治具有重要的意義。而目前僅用低效率的電鏡觀察、RT-PCR方法和核酸雜交等方法對(duì)小樣本進(jìn)行病毒檢測(cè)。本發(fā)明以原核表達(dá)的TYLCV衣殼蛋白（CP）為抗原通過雜交瘤技術(shù)制備了1株抗TYLCV的特異性單克隆抗體，以制備的單抗為核心建立了檢測(cè)TYLCV的高通量的血清學(xué)方法，并成功應(yīng)用于田間TYLCV的檢測(cè)，從而為我國番茄黃花病毒病早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警，防控策略提供物質(zhì)和技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗番茄黃花曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用。

分泌抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏號(hào)為CGMCC?No.5538，它能分泌抗番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體。

雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10^-6以上，抗體類型及亞類為IgG1、kappa鏈，該單克隆抗體能與番茄黃化曲葉病毒的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。

抗番茄黃化曲葉病毒單克隆抗體在該病毒檢測(cè)上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果：1）提供的雜交瘤細(xì)胞株能分泌抗番茄黃化曲葉病毒的特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、Tissue-ELISA、和TAS-ELISA等免疫學(xué)方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒；2）利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備；3）利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間作物中番茄黃化曲葉病毒的檢測(cè)。

附圖說明