[發(fā)明專利]分泌抗水稻黑條矮縮病毒單抗雜交瘤細胞株及其單抗應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210004164.2
• 申請日: 2012-01-09
• 公開（公告）號: CN102533664A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳建祥;周雪平;倪躍群;劉歡;饒黎霞
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/10;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分泌抗水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株及其單抗的應用。?

背景技術(shù)

水稻黑條矮縮病曾于1960?年代中期在浙江及華東諸省市不少地區(qū)的稻、麥和玉米等禾谷類糧食作物上嚴重為害，其中浙江發(fā)病較重致使當時以東陽為中心的浙中玉米種植區(qū)被迫改變栽培制度，此后20?年發(fā)病面積迅速下降直至70?年代銷聲匿跡。近年來由于受耕作栽培制度改變、氣候變暖、灰飛虱暴發(fā)等多種因素影響導致黑條矮縮病在浙江、上海、江蘇、安徽、江西等地發(fā)生、流行。?

水稻黑條矮縮病由水稻黑條矮縮病毒(Rice?black?streaked?dwarf?virus，RBSDV)引起，該病毒屬于呼腸孤病毒科?(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)。該病毒可侵染水稻、大麥、小麥、玉米、高粱、馬唐、白草和稗草等多種禾本科作物和雜草，引起水稻的黑條矮縮病和玉米的矮縮病。病毒粒體球狀，直徑70～75?nm。病毒基因組為雙鏈RNA(dsRNA)，共10個片段，由大到小分別命名為SI～S10，其中S10編碼病毒的外殼蛋白。細胞質(zhì)中病毒粒子以三種形式存在：一種是分散或不規(guī)則聚集，另一種是有規(guī)則的晶狀排列，再一種病毒粒子排列成串，外包一層膜，呈豆莢狀、鞘狀或管狀構(gòu)造。?

水稻黑條矮縮病毒是一種由灰飛虱?（Laodelphax?striatellus?Fallen）為主要傳播媒介的病毒，極具暴發(fā)性、間歇性和遷移性。水稻一旦感染上該病毒就無法防治。?其中秧苗2葉～4?葉心葉期為最易感病期，且極顯著高于其他生育期。因此秧苗期是防治灰飛虱傳毒的關(guān)鍵時期。感病水稻的癥狀表現(xiàn)為分蘗增加，葉片短闊、僵直，葉色深綠，葉背的葉脈和莖稈上初現(xiàn)蠟白色，后變褐色的短條瘤狀隆起，不抽穗或穗小，結(jié)實不良。不同生育期染病后的癥狀略有差異，具體表現(xiàn)為：苗期發(fā)病?心葉生長緩慢，葉片短寬、僵直、濃綠，葉脈有不規(guī)則蠟白色瘤狀突起，后變黑褐色，根短小，植株矮小，不抽穗，大田移栽后枯死；分蘗期發(fā)病?新生分蘗先顯癥，主莖和早期分蘗尚能抽出短小病穗，但病穗縮藏于葉鞘內(nèi)；拔節(jié)期發(fā)病?劍葉短闊，穗頸短縮，結(jié)實率低，葉背和莖稈上有短條狀瘤突。?

水稻黑條矮縮病毒傳毒介體灰飛虱一經(jīng)獲毒，終身帶毒，但不經(jīng)卵傳毒。病毒主要在大麥、小麥病株上越冬，有部分也在灰飛虱體內(nèi)越冬。田間病毒通過麥-早稻-晚稻的途徑完成侵染循環(huán)。第一代灰飛虱在病麥上接毒后傳到早稻、單季稻、晚稻和青玉米上傳毒。稻田中繁殖的2、3代灰飛虱，在水稻病株上吸毒后，遷入晚稻和秋玉米傳毒，晚稻上繁殖的灰飛虱成蟲和越冬代若蟲又進行傳毒，傳給大麥、小麥。灰飛虱最短獲毒時間30分鐘，1-2天即可充分獲毒，病毒在灰飛虱體內(nèi)循回期為8-35天，接毒時間僅1分鐘。灰飛虱帶毒情況及發(fā)生數(shù)量成為水稻黑條矮縮病發(fā)病流行的重要因素。為了掌握灰飛虱自然種群帶毒及水稻發(fā)病狀況，強化我國水稻黑條矮縮病早期監(jiān)測和預警，科學指導防控，急需建立檢測灰飛虱體內(nèi)及水稻中RBSDV的高通量的檢測方法，而目前沒有這種高通量的檢測方法，僅用低效率的電鏡觀察、RT-PCR方法等方法進行小樣本檢測。本發(fā)明以RBSDV外殼蛋白（CP）為抗原通過雜交瘤技術(shù)制備了1株抗RBSDV的特異性單克隆抗體，以制備的單抗為核心建立了檢測RBSDV的高通量的血清學方法，并成功應用于田間RBSDV的檢測，從而為我國水稻黑條矮縮病早期監(jiān)測和預警，科學指導防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其單抗應用。?

分泌抗水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株，保藏號為CGMCC?No.5537，它能分泌抗水稻黑條矮縮病毒的單克隆抗體。?

抗水稻黑條矮縮病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價達10^-6以上，抗體類型及亞類為IgG1、kappa鏈，該單克隆抗體能與水稻黑條矮縮病毒?56kD的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應。?

抗水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體在該病毒檢測上的應用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學檢測方法和免疫學試劑盒。?