[發明專利]一株無色桿菌及其不對稱催化還原碳碳雙鍵的方法

有效

• 申請號: 201210004039.1
• 申請日: 2012-01-08
• 公開（公告）號: CN102559553A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 吳中柳;劉艷杰;林暉
• 申請（專利權）人: 中國科學院成都生物研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P13/00;C12R1/025
• 代理公司: 成都賽恩斯知識產權代理事務所(普通合伙) 51212
• 代理人: 肖國華

技術領域

本發明屬于生物化學技術領域，具體涉及一株無色桿菌并應用該菌轉化(Z)-3-芳基-3-氰基-丙烯酸，環狀酰亞胺和不飽和硝基化合物制備光學純缺電子烷烴化合物的方法，是無色桿菌屬首次應用于不對稱催化還原碳碳雙鍵。?

背景技術

光學純缺電子烷烴化合物是有機合成中的重要合成塊，可以用來制備光學純手性藥物。碳碳雙鍵還原酶(enoate?reductase)不對稱催化還原帶有強吸電子基團的碳碳雙鍵，可同時得到具有一個或兩個手性中心的光學純缺電子烷烴化合物，是廣泛用來制備手性缺電子烷烴類的方法之一(Stuermer?et?al.2007?Asymmetric?bioreduction?of?activated?C＝C?bonds?using?enoate?reductases?from?the?old?yellow?enzyme?family.[Review].Curr?Opin?Chem?Biol?11：203-213)。近幾十年來，隨著不對稱催化還原帶有強吸電子基團的碳碳雙鍵的快速發展，越來越多合成家開始關注碳碳雙鍵還原酶的新酶源的開發及底物譜的擴增。經過數十年的探索，已經從許多不同的生物來源中得到了碳碳雙鍵還原酶，如高等植物(地錢，長春花，煙草，番茄等)，細菌和真菌(Toogood?et?al.2010?Biocatalytic?Reductions?and?Chemical?Versatility?of?the?Old?Yellow?Enzyme?Family?of?Flavoprotein?Oxidoreductases.Chemcatchem?2：892-914)。由于微生物具有培養簡單，周期短等特點，所以在全細胞催化的生物轉化中，絕大數為微生物。相比之下，植物細胞培養比較復雜，不僅需要光照，而且周期較長，因此很少用于生物轉化中。?

碳碳雙鍵還原酶不對稱催化還原的底物類型主要有：烯醛、烯酮、炔酮、不飽和硝基、不飽和硝基酯、不飽和腈、不飽和羧酸及其衍生物(Toogood?et?al.2010?Biocatalytic?Reductions?and?Chemical?Versatility?of?the?Old?Yellow?Enzyme?Family?of?Flavoprotein?Oxidoreductases.Chemcatchem?2：892-914)。與生物催化羰基還原相比，生物催化碳碳雙鍵還原的研究較少，商品化的碳碳雙鍵還原酶更少(Chaparro-Riggers?et?al.2007Comparison?of?three?enoate?reductases?and?their?potential?use?for?biotransformations.Adv?Synth?Catal?349：1521-1531)。其主要原因是酶的活力低、穩定性差，不適合應用。因此，新型酶源的發掘對于發展碳碳雙鍵還原酶具有重要意義。?

發明內容

本發明的目的是公開一株無色桿菌，該菌于2011年10月31日在中國武漢武漢大學中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為：CCTCC?M?2011369，分類命名：Achromobacter?sp.JA81，?并利用該菌具有生產高活力、高對映選擇性的碳碳雙鍵還原酶的特性，還原底物(Z)-3-芳基-3-氰基-丙烯酸制備光學純(R)-3-芳基-3-氰基丙酸，該(R)型產物是合成光學純γ-氨基丁酸的關鍵手性中間體。同時，該菌還可以催化環狀酰亞胺和不飽和硝基化合物制備光學純缺電子烷烴類化合物。為無色桿菌首次用于不對稱催化還原碳碳雙鍵。?

本發明無色桿菌(Achromobacter?sp.JA81)的篩選方法：?

以檸檬醛和(Z)-2-苯基丁-2-烯腈為唯一碳源對來自成都龍泉果園和四川師范大學果園的土壤樣品進行富集，得到純培養菌株46株，以此46株菌株對模式底物馬來酰亞胺進行生物轉化，得到活力菌株16株，將此16株菌株對目標底物(Z)-3-苯基-3-氰基-丙烯酸進行生物轉化，對目標底物有活性的菌株進行進一步的鑒定。經篩選得到本發明涉及的無色桿菌JA81。具體方案見實施例。?

以無色桿菌JA81作為生物催化劑，轉化目標底物(Z)-3-苯基-3-氰基-丙烯酸生成相應的(R)-3-苯基-3-氰基丙酸。具體方法如下：?

1.菌株培養：?

斜面保存培養基組分為：胰蛋白胨1g/100mL；酵母提取物0.5g/100mL；NaCl?1g/100mL；瓊脂粉2g/100mL；?