[發(fā)明專利]一種在釀酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG標記的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210003954.9
• 申請日: 2012-01-09
• 公開（公告）號: CN103194469A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發(fā)明（設計）人: 張震宇;顧春銀;李忠浩;楊冬美
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種在釀酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG標記的方法，其特征在于使該菌蛋白Rav2pC末端上帶有FLAG標記，并插入抗生素G418抗性基因KanMX6。

2.按照權(quán)利要求1所述，其特征在于使釀酒酵母蛋白Rav2p的C末端上帶有FLAG標記的方法包括如下步驟：

A.設計Rav2p基因終止密碼子前400bp片段的一對引物Rfkanp1和Rfkanp2，把這段片段命名為同源左臂，其中Rfkanp2后半部分為FLAG標記的基因序列；

Rfkanp1：GGTGACTAAAAAACCTTGG；

Rfkanp2：cttgtcatcgtcgtccttgtagtcCTTATATGTACTTAACTGTTTGCTA????(FLAG)；

B.設計Rav2p基因下游400bp片段的一對引物Rfkanp5和Rfkanp6，把這段片段命名為同源右臂；

Rfkanp5：TCTACTAGCGATAACATTAACA；

Rfkanp6：ATTAGATTTGATTGAAGAG；

C.以釀酒酵母基因組為模板，通過引物Rfkanp1和Rfkanp2擴增同源左臂；

D.以釀酒酵母基因組為模板，通過引物Rfkanp5和Rfkanp6擴增同源右臂。

3.按照權(quán)利要求1所述，其特征在于使釀酒酵母含有抗生素G418抗性基因KanMX6的方法包括如下步驟：

A.設計KanMX6基因的引物Rfkanp3和Rfkanp4；

Rfkanp3：gactacaaggacgacgatgacaagTAGTGAATTCGCGCCACTTC????(FLAG)；

Rfkanp4：TGTTAATGTTATCGCTAGTAGAGAATTCGAGCTCGTTTAAA；

B.以含有KanMX6基因的釀酒酵母SF838-5A?RAV1-Myc13基因組為模板，通過引物Rfkanp3和Rfkanp4擴增KanMX6基因；

C.利用融合PCR技術(shù)連接同源左臂、抗生素G418抗性基因KanMX6、同源右臂；

D.將連接的DNA片段導入釀酒酵母，接種于含有G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選陽性克隆。