[發(fā)明專利]一種從釀酒酵母細(xì)胞中高效提取高分子量基因組的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210003952.X
• 申請日: 2012-01-09
• 公開（公告）號: CN103194440A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張震宇;顧春銀;徐燦;李忠浩;楊冬美
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12R1/865
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物的分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別提供了一種從釀酒酵母細(xì)胞中高效提取高分子量基因組的方法。通過該方法提取的基因組可以滿足許多分子生物學(xué)分析的需要。

背景技術(shù)

釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)為低等真核生物，與同屬真核生物的動物和植物細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上有很多相似性。早在1996年釀酒酵母的基因組測序工作就已完成，是被人們了解最多的微生物之一。釀酒酵母具有易于培養(yǎng)且繁殖迅速的特點(diǎn)，經(jīng)常被用來作為研究真核生物的工程菌。釀酒酵母被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)和基因工程領(lǐng)域。目前對釀酒酵母的研究已經(jīng)上升到了分子水平，隨著對其生理機(jī)制研究的深入，釀酒酵母的一些功能蛋白的基因經(jīng)常被用來在其它工程菌中克隆、表達(dá)。研究中對于釀酒酵母基因組的需求，無論是在量或質(zhì)上都大為提高。

目前實(shí)驗(yàn)室提取酵母基因組DNA的方法主要有試劑盒法、液氮研磨法、化學(xué)試劑法。但這些方法往往只能適用于部分酵母，缺乏通用性，對于釀酒酵母基因組的提取，效果往往不夠理想。由于缺乏專門針釀酒酵母這一特定酵母基因組的提取方法，本專利通過多次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程和試劑配方，總結(jié)出一種從釀酒酵母細(xì)胞中高效提取高分子量基因組的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有酵母基因組提取方法的不足，本發(fā)明提供了一種從釀酒酵母細(xì)胞中高效提取高分子量基因組的方法，包括破壁、去除組蛋白和RNA、抽提、沉淀、溶解，具體工藝過程如下：

破壁：破解細(xì)胞壁與細(xì)胞膜是提取基因組DNA的基礎(chǔ)，由于釀酒酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比細(xì)菌細(xì)胞壁更為堅(jiān)固、厚實(shí)，一般的溶菌酶并不能有效的分解釀酒酵母的細(xì)胞壁，因此本專利使用lyticase來破除細(xì)胞壁。

用500μl的山梨醇緩沖液懸浮釀酒酵母，加入40μl、1000U/ml的lyticase和1μlβ-巰基乙醇，混勻后37℃孵育3h。

去除組蛋白和RNA：對破壁后的細(xì)胞使用蛋白酶k和RNase去除染色體上的組蛋白和不需要的RNA。

8000r/min?1min離心棄上清(加速要慢)，加500μlTE緩沖液(pH8.0)，混勻后加50μl、10％SDS，加入10μl、200mg/ml蛋白酶k，再加入10μl、10g/ml?RNase，37℃孵育1h。

抽提：加入500μl平衡酚，顛倒混勻、靜置5min，8000r/min離心1mmin。移取上層加入250μl平衡酚和250μl氯仿∶異戊醇(24∶1)顛倒混勻、靜置5min，加500μl氯仿，顛倒混勻、靜置5min，8000r/min離心1min，取上層水相。

沉淀：取上層水相，加入2倍體積無水乙醇，-20℃放置1h。12000r/min離心10min。

溶解：棄上清并置于超凈臺吹干，加入50μl?ddH₂O溶解DNA。

所述山梨醇緩沖液為：1mol/L，pH?7.5；

所述TE緩沖液為：1mol/LTris·Cl，pH?8.0，0.5mol/L?EDTA，0.5mol/L檸檬酸，加水至1000ml；

Lyticase(1000U/ml)蛋白酶k(200mg/ml)RNase(10g/ml)。

本發(fā)明從影響釀酒酵母基因組提取的質(zhì)和量入手，將破壁和去除蛋白、RNA的過程分開，分別采用不同的緩沖液及添加還原劑來保證破壁的效率和除去雜質(zhì)的效果。在工藝過程上進(jìn)行了更細(xì)致的優(yōu)化，增加了抽提的次數(shù)，使基因組更加完整并提高了純度，能更好地滿足分子生物學(xué)的需求。

附圖說明

圖1：1、2、3為本方法提取的基因組；4為用蝸牛酶法；5為SDS反復(fù)凍融法；M為λ-HindIII?digestDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

挑取釀酒酵母BY4742單菌落培養(yǎng)至OD≈3，收集濕重約1g的新鮮菌體，山梨醇洗滌一次；

加入500μl的山梨醇緩沖液懸浮釀酒酵母，加入40μl、1000U/ml的lyticase和1μlβ-巰基乙醇，混勻后37℃孵育3h；

8000r/min?1min離心棄上清(加速要慢)，加500μl?TE緩沖液(pH8.0)，混勻后加50μl、10％SDS，加入10μl、200mg/ml蛋白酶k，再加入10μl、10g/ml?RNase，37℃孵育1h；