[發明專利]一種采用熒光RT-PCR技術檢測牙鲆TLR21基因表達的方法

無效

• 申請號: 201210003934.1
• 申請日: 2012-01-09
• 公開（公告）號: CN102534000A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 高虹;吳戀;耿緒云;孫金生;潘寶平
• 申請（專利權）人: 天津師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發明得到天津市自然科學基金?基礎研究計劃（10JCYBJC09100）；天津師范大學博士基金項目(自然科學)?項目號：52XB1004；天津師范大學市級重點實驗室開放研究基金的資助。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，涉及用于檢測牙鲆TLR21基因表達的特異性引物,更具體的說是一種采用熒光RT-PCR技術檢測牙鲆TLR21基因表達的方法。主要用于牙鲆TLR21基因表達調控機理研究和免疫學功能研究，以及牙鲆早期病原感染的監測。

背景技術

隨著世界范圍水產養殖規模的擴大，國內外水產品貿易及水產苗種跨區域交流日益頻繁，大大增加了水產養殖動物病原傳播的機會。同時，由于現代水產養殖的集約化、高密度生產方式及漁業水域環境的惡化，又常會引發養殖動物的應激反應，導致機體的免疫系統受到抑制。正是這些因素相互影響，出現了全球性的水產養殖動物發病率趨于頻繁、流行程度日益廣泛、經濟損失極為巨大的局面。運用現代生物技術作為水產養殖的技術支撐，掌握病害的免疫防御技術是水產科技急需解決的首要問題，因此，近年來國際上魚類免疫學的研究逐漸受到重視。

在人類免疫學研究的歷史舞臺上,?細胞免疫和體液免疫一直是兩個主角。相比之下,?固有免疫的研究由于缺乏對其相應受體的系統認識,?明顯滯后于獲得性免疫研究的進程。20世紀90年代,?Janeway?等有關“病原體相關分子模式”以及“模式識別受體”概念的提出,?標志著固有免疫研究進入了一個嶄新的階段。魚類雖是低等脊椎動物，但已具備免疫的基本特性，與哺乳動物一樣，其體內也存在2種免疫應答類型：固有免疫應答和獲得性免疫應答。而相對于哺乳動物來說，魚類的固有免疫研究才剛剛起步。

Toll樣受體（Toll-like?receptors，TLRs）家族是動物識別入侵病原體的主要?“模式識別受體”，可識別幾乎所有病原生物的一些通用結構，是啟動固有免疫應答的關鍵。一般認為TLR?1、2、4、5和6主要參與細菌成分的識別，而TLR3、TLR7和TLR8主要特異地針對病毒成分，TLR9對這二者均能夠識別。TLR14、21～23在某些魚類中存在，在哺乳動物中還未發現。有研究報道TLR21即可識別細菌成分，也可識別病毒成分。

牙鲆(Paralichthys?olivaceus)在我國俗稱牙片、偏口、比目魚，是我國北方海水工廠化養殖的主要名貴魚類品種，同時也是重要的海水增養殖魚類之一。牙鲆屬于鰈形目，鲆科，牙鲆屬。牙鲆屬的魚類在南、北美洲東西岸較多，而亞洲沿岸只有牙鲆一種，主要分布于渤海、黃海、東海、南海以及朝鮮、日本、俄羅斯沿岸海區。近年來，腹水病、病毒性神經壞死癥等各種病害的爆發和流行給生產企業造成了巨大的經濟損失，嚴重阻礙了牙鲆養殖產業的發展。腹水病在牙鲆疾病中危害最為嚴重,該病從苗種到成魚均有發生,死亡率可達50%-80%。由于目前對牙鲆免疫機理和機制的了解較少，尚無有效的免疫防治技術和治療方法。

TLRs是宿主免疫的必需分子之一,?通過感知病原微生物體，識別病原相關分子模式，激活天然免疫系統。TLR21作為TLRs家族的成員，參與魚類免疫調節，在一定程度上反映了魚類的免疫能力，因此可以作為魚類疾病防治中免疫監測的指標。

實時熒光PCR技術是在常規PCR技術的基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光PCR不僅實現了常規PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，實時熒光PCR技術由自動化儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，可進一步提高靈敏度；實時熒光PCR技術全封閉反應，無須PCR后處理，避免污染，保證了結果的可靠性和重復性。目前，已廣泛應用于分子生物學和醫學研究等領域。隨著實時熒光PCR試劑盒的進一步開發，近年來，實時熒光PCR技術在動物疫病診斷中也得到了廣泛的應用。

發明內容

本發明的目的是公開一種采用熒光RT-PCR技術檢測牙鲆TLR21基因表達的方法。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案如下:

設計一種采用熒光RT-PCR技術檢測牙鲆TLR21基因表達的特異性引物，其特征在于包括符合熒光PCR反應特點的特異上下游引物：TLR21-q-F：5'-TAAACTTTGCCTACATCACA-3'；TLR21-q-R：5'-?AACACGAGCAGAAGAACAT?-3'；

以及作為內參基因的牙鲆β-actin特異上下游引物：β-actin-F：5'-AGGTTCCGTTGTCCCG-3';β-actin-R：5'-TGGTTCCTCCAGATAGCAC-3'。