[發(fā)明專利]一個(gè)參與丹參酮生物合成的CYP450基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210003925.2
• 申請(qǐng)日: 2012-01-09
• 公開（公告）號(hào): CN102676549A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃璐琦;郭娟;申業(yè);張夏楠;高偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N9/02;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/19;C12P7/22;A01H5/00
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及利用丹參轉(zhuǎn)錄組文庫篩選丹參酮類化合物代謝途徑相關(guān)CYP450基因，并利用體外酶促反應(yīng)的方法對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行功能活性分析，涉及到丹參主要活性成分丹參酮類化合物生物合成途徑中CYP450基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用，屬于藥用植物基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

藥用植物有效成分的形成是植物次生代謝途徑中特有基因表達(dá)的產(chǎn)物，隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨(dú)具特色又有廣闊應(yīng)用前景的藥用植物次生代謝合成相關(guān)功能基因的研究逐漸成為研究的熱點(diǎn)，這些基因的克隆將為詮釋藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制、為藥材品質(zhì)的形成提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為利用生物技術(shù)提高目標(biāo)成分含量或直接生產(chǎn)有效成分或中間體帶來廣闊的應(yīng)用前景。

丹參為唇形科鼠尾草屬藥用植物丹參(Salvia?miltiorrhiza?Bunge)的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩等功效，其主要有效成分包括脂溶性的丹參酮和水溶性的丹酚酸。其中丹參酮類主要包括隱丹參酮、丹參酮IIA、丹參酮IIB和二氫丹參酮等，具有擴(kuò)張血管、抗血栓、抗菌消炎以及抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用，在制藥以及美容、化妝品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。丹參酮類化合物為松香烷型二萜琨類化合物，其生物合成在萜類化合物前體物質(zhì)合成的基礎(chǔ)上，通過異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶(Prenyl?Transferases，PT)的作用產(chǎn)生20個(gè)碳原子的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(Geranylgeranyl?Diphosphate，GGPP)，GGPP進(jìn)一步在丹參柯巴基焦磷酸合酶(S.miltiorrhiza?Copalyl?Diphosphate?Synthase，SmCPS)和丹參類貝殼杉烯合酶(S.miltiorrhiza?ent-kaurene?Synthase，SmKS)的作用下形成丹參類化合物的基本骨架次丹參酮二烯(Miltiradiene)，在次丹參酮二烯的基礎(chǔ)上經(jīng)過甲基化和羥基化等形成丹參酮類化合物，其中細(xì)胞色素P450(CYP450)酶在修飾過程發(fā)揮著重要作用。

CYP450酶為血紅蛋白結(jié)合蛋白，在所有已知的CYP450酶中都存在一個(gè)保守的血紅素結(jié)合域，是鑒定該基因的一個(gè)重要特征。擬南芥基因組中有272個(gè)CYP450基因，水稻基因組注釋顯示有457個(gè)CYP450基因，如此龐大的基因家族反映了植物次生代謝物的復(fù)雜多變。各種CYP450酶催化的反應(yīng)廣泛并且復(fù)雜，包括：羥基化、N-、O-和S-端的脫烷基化、環(huán)氧基化、脫氨基作用、脫硫、脫鹵作用和過氧化反應(yīng)等。盡管催化反應(yīng)各異，催化機(jī)理卻相同，即通過NADPH或者NADH為CYP450傳遞電子，激活氧分子，將其中的一個(gè)氧插入到底物上，同時(shí)生成一分子水。CYP450酶作為萜類、黃酮類、脂肪酸類和植物激素等合成代謝途徑的一類重要酶蛋白，不但催化相關(guān)代謝反應(yīng)，由于大多數(shù)的CYP450蛋白均有一段內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位蛋白，因此在代謝區(qū)室(Metabolon)的酶復(fù)合體中還具有固定酶復(fù)合體的作用。隨著分子生物學(xué)以及相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，次生代謝途徑相關(guān)的CYP450基因功能逐漸得以驗(yàn)證。真核表達(dá)、原核表達(dá)以及RNA干擾(RNA?Interference)等技術(shù)在CYP450基因的功能驗(yàn)證中發(fā)揮了重要作用。近年來利用真核表達(dá)以及RNAi技術(shù)使得CYP450酶在紫杉酚、青蒿素、植物抗毒素等代謝途徑中的重要作用逐漸被解析。但是作為在植物次生代謝中發(fā)揮作用的CYP450表達(dá)量相對(duì)較低，并且大多CYP450蛋白具有嚴(yán)格的催化底物結(jié)構(gòu)特異性，同時(shí)基因組中廣泛存在的CYP450基因?yàn)榇紊x相關(guān)基因的克隆和功能驗(yàn)證提供了難度，使之成為了近年來國際學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)之一。

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究的基礎(chǔ)上已克隆到了丹參酮化合物合成途徑的上游的相關(guān)關(guān)鍵酶基因，并通過構(gòu)建工程菌產(chǎn)生了丹參酮化合物的前體次丹參酮二烯。本發(fā)明涉及的是催化次丹參酮二烯(Miltiradiene)在C-12的羥基化產(chǎn)生丹參酮類化合物合成途徑中間產(chǎn)物鐵秀醇(Ferruginol)的關(guān)鍵CYP450酶基因，該基因是首次從丹參中得到的丹參酮類生物合成的關(guān)鍵CYP450基因，依據(jù)CYP450基因命名法則命名為CYP76Q1。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報(bào)道過本專利申請(qǐng)中涉及的CYP76Q1基因及其氨基酸序列。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)丹參酮化合物生物合成代謝途徑的CYP450基因CYP76Q1，其編碼的蛋白在含有NADPH的緩沖體系中能催化次丹參酮二烯生成鐵銹醇。