[發明專利]一種新型高效液相色譜介質及其制備方法

有效

• 申請號: 201210003448.X
• 申請日: 2012-01-09
• 公開（公告）號: CN102513071A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 夏海鋒;金雄華;吳璞強;鄭夢杰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: B01J20/283
• 分類號: B01J20/283;B01J20/30
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種新型高效液相色譜介質及其制備方法

背景技術

高效液相色譜(HPLC)是一種強有力并被廣泛使用的純化和分析復雜組分的技術，而傳統的高效液相色譜大部分都是基于反相色譜原理的。反相層析(RPC)是根據蛋白質的高表面張力進行吸附，通過降低表面張力進行洗脫的；層析介質上的非極性基團可以和蛋白質或多肽表面的疏水部位進行相互作用；在水溶液中目標物質具有較高的極性而吸附，通過在洗脫液中添加有機溶劑降低極性達到洗脫的目的。傳統的高效液相色譜介質大部分都是通過在介質上連接一定長度的碳鏈，起功能化作用，目標產物吸附后，再用有機溶劑梯度洗脫，具有分辨率高的優點。但是有機溶劑極易造成蛋白質的變性，使高效液相色譜技術在蛋白質的分離應用受到了限制。

具有吡啶基的疏水性電荷誘導型配基屬于弱堿性化合物，在pH?4-10的范圍內不帶電荷，可以避免靜電作用對雜質的吸附，配基可以通過疏水作用與蛋白質相結合，而當pH值降低到配基的pKa以下時，雜環質子化，若此時蛋白質也帶有正電荷，可通過靜電排斥作用實現洗脫。這種以疏水作用吸附、靜電排斥協助解析的過程是HCIC的最大特征，可通過將流動相pH降低到4.0-4.55進行洗脫，避免反相色譜中有機溶劑對蛋白質活性的液相。由此可見，疏水性電荷誘導層析是一種應用廣闊的新型層析分離方法。

然而大部分的疏水性電荷誘導型層析介質，都以瓊脂糖、纖維素等水凝膠為基質材料的，很難應用于高效液相色譜中。氧化硅具有機械強度高、孔隙率和比表面積大、極性可調節和表面易修飾等優點，因而被廣泛地用作高效液相色譜介質的基質材料，可通過硅烷化試劑引入所需的配基來制備高效液相色譜介質。

因此，本發明將新型疏水性電荷誘導型配基引入高效液相色譜技術中，以二氧化硅微球為載體，通過硅烷化試劑引入吡啶基，可以提高對蛋白質的選擇性和分辨率，并可在較溫和的條件下洗脫，形成一種高效的蛋白質分離新方法，有效促進蛋白質分離工藝的改進和提高。

發明內容

本發明的目的是提供一種新型高效液相色譜介質及其制備方法。

新型高效液相色譜介質，其介質的組成中基質為多孔二氧化硅微球，功能配基為通過硅烷化試劑引入的吡啶基，具有吡啶基的硅烷化試劑的結構為：

所述的多孔二氧化硅微球的粒徑為5-30μm。具有吡啶基的硅烷化試劑的吡啶基包括2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基。具有吡啶基的硅烷化試劑的結構中的R構成了碳鏈，R構成單元為CH₂或CHOH，長度為0-6個碳。配基密度為5-150μmol/mL介質。

新型高效液相色譜介質的制備方法如下：取10-20mL多孔氧化硅微球于110℃烘箱中充分干燥24h，冷卻后轉移至250mL圓底燒瓶中；再加入100-180mL甲苯、2-10g具有吡啶基的硅烷化試劑，通入氮氣；升溫至50-150℃，100-250r/min下攪拌回流5-24h；反應完畢后，過濾收集微球，用甲苯和丙酮清洗并烘干。

本發明所研制的高效液相色譜介質，具有疏水性電荷誘導分離原理，具有制備方法簡單、成本低廉、配基密度高、蛋白吸附量大、特異性強和吸附洗脫條件溫和等優點，可用于蛋白質的高效分離純化。制備工藝的關鍵是：將多孔氧化硅微球充分干燥后，在氮氣保護下，于甲苯中與具有吡啶基的硅烷化試劑進行加熱反應，一步即可得到新型疏水性電荷誘導型高效液相色譜介質。

具體實施方式

以下通過實施例對本發明作進一步的描述：

實施例1

取10mL多孔氧化硅微球于110℃烘箱中充分干燥24h，冷卻后轉移至250mL圓底燒瓶中；再加入150mL甲苯、2g具有吡啶基的硅烷化試劑2-(2-吡啶基)乙基三甲氧基硅烷，通入氮氣；升溫至80℃，200r/min下攪拌回流12h；反應完畢后，過濾收集微球，用甲苯和丙酮清洗并烘干，配基密度為77μmol/mL。

實施例2

取10mL多孔氧化硅微球于110℃烘箱中充分干燥24h，冷卻后轉移至250mL圓底燒瓶中；再加入150mL甲苯、3g具有吡啶基的硅烷化試劑2-(3-吡啶基)乙基三甲氧基硅烷，通入氮氣；升溫至85℃，200r/min下攪拌回流10h；反應完畢后，過濾收集微球，用甲苯和丙酮清洗并烘干，配基密度為79μmol/mL。

實施例3