[發明專利]一種用于絲狀真菌顯微形態觀察的制片方法

無效

• 申請號: 201210001981.2
• 申請日: 2012-01-05
• 公開（公告）號: CN102533930A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 李偉;單秀娟;程曉麗
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學;中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;G02B21/34
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

技術領域

本發明屬于真菌學研究領域，具體涉及一種用于絲狀真菌顯微形態觀察的制片方法。

背景技術

長期以來，對絲狀真菌的生物學鑒定主要是以菌體的形態特征為依據，因此，獲得較好的菌體顯微形態觀察玻片對于準確鑒別絲狀真菌種類就至關重要。目前，制作絲狀真菌觀察玻片的傳統方法的步驟如下：首先用挑針直接挑取培養基上的真菌培養物，置于載玻片上；然后小心地將挑取的菌絲體用挑針分散開，蓋上蓋玻片。但此方法存在以下幾個明顯的缺點：(1)由于傳統制片方法極易出現菌體重疊，難以獲得觀察效果較好的玻片，即使技術嫻熟的操作人員也需要大量制片，才能獲得符合觀察要求的觀察玻片；(2)在挑片過程中，真菌孢子在載孢體上的自然著生狀態極易遭到人為破壞，因此，傳統挑片法獲得的觀察玻片往往難以反映真菌的產孢方式與類型，而此項特征正是絲狀真菌分類中最為關鍵的鑒別要素；(3)挑片獲得的觀察玻片中，菌體往往處于發育后期，通過挑片的方法幾乎不可能獲得發育早期的菌體，這對研究真菌不同發育階段菌體形態特征十分不利。因此，在絲狀真菌鑒定領域就需要建立一種新的制片方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于絲狀真菌顯微形態觀察的制片方法，即針對傳統制片方法的嚴重缺陷而建立的一種新的制片方法，便于更加全面、精確地觀察絲狀真菌的顯微形態特征，以保證菌種鑒定工作的準確性，從而彌補現有技術的不足。

本發明的方法，其步驟如下：首先在水瓊脂培養平板上挖取一個凹槽，移除凹槽內的培養基；再將一塊尺寸小于凹槽的水瓊脂培養基塊放置在凹槽內，挑取待鑒定真菌培養物接種于位于凹槽內的水瓊脂培養基塊朝上的一面，然后將無菌蓋玻片蓋于水瓊脂培養基塊上；蓋上培養皿蓋，密封后于室溫下培養，培養結束后取出蓋玻片，制作成真菌的觀察玻片。

上述的水瓊脂培養平板的制備方法如下：在1000ml蒸餾水中加入15克瓊脂粉后，121℃，98.1kPa滅菌，最后倒入無菌培養皿中冷卻。

上述的凹槽為方形，其大小為1.6×1.6cm²。

上述的水瓊脂培養基塊的大小為0.4×0.4cm²。

上述的無菌蓋玻片大小為1.8×1.8cm²。

本發明的方法制作絲狀真菌的菌體觀察玻片簡單易操作，可以根據不同菌種的生長周期，采用連續取片的方式，獲得不同發育時期的菌體觀察玻片，保證了絲狀真菌物種鑒定工作的準確性。

具體實施方式

本發明的更具體的實施步驟：

(1)配制水瓊脂培養基，高壓滅菌(121℃，98.1kPa)后倒入已滅菌的培養皿(直徑9cm)中，每皿約20ml，待其自然凝固后，用解剖刀在培養平板上挖取3-4個1.6×1.6cm的方形凹槽，移除凹槽內的培養基；

(2)移除凹槽內培養基之前，用解剖刀切取0.4×0.4cm的水瓊脂培養基塊，并放置于凹槽中心位置；

(3)將培養了一定時期的待鑒定真菌培養物用挑針挑取少許接種于位于方形凹槽中心的0.4×0.4cm的水瓊脂培養基塊朝上的一面；

(4)將已滅菌的大小為1.8×1.8cm的蓋玻片蓋于其上，并使得凹槽中心的培養基塊位于蓋玻片中央，然后蓋上培養皿蓋并密封，于室溫下培養；

(5)根據不同種類絲狀真菌的生長特點，在培養的第3天，第6天，第10天和第15天，分別取出1-2片蓋玻片，選用合適的浮載劑，制作觀察玻片，即可用于觀察不同發育時期的菌體形態特征。上述實施步驟的(1)-(4)需要在超凈臺中完成。

通過顯微鏡觀察，本發明方法制備的絲狀真菌顯微形態的蓋玻片上的菌體處于自然生長狀態，很少出現菌體重疊現象，更為重要的是，由于菌體的自然生長狀態未受破壞，制作的觀察玻片利于形態特征(如產孢方式和類型)的顯微觀察。通過采用在不同培養時間取出蓋玻片的方式制作觀察玻片，實現了對菌體生長發育狀況的連續觀察，可以獲得全面反映菌體不同發育時期形態特征的觀察玻片，從而掌握包括絲狀真菌產孢方式和孢子形成的動態變化過程，有利于對真菌物種進行準確鑒定。