[發明專利]一種誘導干細胞神經分化的方法

有效

• 申請號: 201210001817.1
• 申請日: 2012-01-05
• 公開（公告）號: CN102533647A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 李廷玉;畢楊;龔敏;陳潔;魏小平;張贇
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學附屬兒童醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/0793
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

1.一種誘導干細胞神經分化的方法，其特征在于使用全反式維甲酸（all-trans??retinoic?acid,?ATRA)作為誘導劑，改良神經誘導培養基（modified?neuronal?induction?medium,?MNM）作為培養基處理干細胞。

2.?根據權利要求1所述誘導干細胞神經分化的方法，其特征在于所述ATRA的濃度優選為1μM。

3.?根據權利要求1或2所述誘導干細胞神經分化的方法，其特征在于所述ATRA誘導時間為24小時。

4.?根據權利要求3所述誘導干細胞神經分化的方法，其特征在于所述MNM的配方為2%DMSO,?200μM?BHA，25mM?KCL，2mM丙戊酸，8μM?forsklin，lμM?氫化可的松和5μg/ml胰島素的DMEM/F12培養液。

5.?根據權利要求1或2所述誘導干細胞神經分化的方法，其特征在于所述干細胞為骨髓間充質干細胞（mesenchymal?stem?cells,?MSCs）。

6.?根據權利要求5所述誘導干細胞神經分化的方法，其特征在于所述骨髓間充質干細胞來源于大鼠。

7.?根據權利要求1或2所述誘導干細胞神經分化的方法，其特征在于由以下步驟組成：

(1)分離培養及鑒定原代大鼠MSCs；

(2)誘導原代大鼠MSCs分化：加入ATRA進行預誘導24小時，再加入MNM?

(含2%DMSO，200μM?BHA，25mM?KCL，2mM丙戊酸，8μM?forsklin，lμM?氫化可的松和5μg/ml胰島素的DMEM/F12培養液)誘導24小時。

8.?根據權利要求7所述誘導干細胞神經分化的方法，其特征在于由以下步驟組成：

（1）分離培養及鑒定原代大鼠MSCs：取SPF級4～8周齡SD大鼠，取股骨，5ml空針吸取DMEM/F12反復沖洗骨髓腔及干垢端，離心去上清，加DMEM/F12/10%FBS/1%青鏈霉素完全培養基吹打，按3×10⁶個／瓶的濃度接種在底面積25cm²?的塑料培養瓶中，置于37℃，5%CO₂濕化孵箱中培養，24小時后傾去上清液及未貼壁細胞，加入新鮮培養液；隨后每3天換液；細胞融合度達80%后胰蛋白酶消化離心，按1：2或1：3的濃度傳代，3-5代細胞用于實驗；流式細胞技術檢測CD106、CD90、CD45、CD34等干細胞標志；

（2）MSCs神經誘導方案的優化：MSCs以3×10⁶/ml濃度接種于在底面積25cm²?的塑料培養瓶中，培養皿或細胞孔板中，6～8小時細胞貼壁后加入終濃度為0-100μM的ATRA進行預誘導，24小時后全量換液去除預誘導液，D-hank’s?洗細胞2-3次，盡量去除殘留血清，加入MNM?(含2%DMSO,?200μM?BHA，25mM?KCL，2mM丙戊酸，8μM?forsklin，lμM?氫化可的松和5μg/ml胰島素的DMEM/F12培養液)誘導24小時；光鏡下觀察細胞存活情況及神經樣細胞的形態，計算神經分化效率；Real-time?PCR?檢測神經細胞相關標志的表達水平，臺盼藍染色實驗檢測分化后神經樣細胞的存活率，確定最佳誘導方案；

（3）誘導后神經樣細胞的鑒定：免疫熒光檢測NESTIN、NES、MAP-2、NF等神經元標志GFAP、CD68、BNDF等神經表面標志；全細胞膜片鉗檢測細胞靜息電位，鈣影像測定KCl刺激后細胞的胞內鈣離子濃度變化。

9.?根據權利要求1或2所述誘導干細胞神經分化的方法制得的具有一定神經元功能的神經樣細胞，由上述誘導干細胞神經分化的方法制得。