[發明專利]新城疫病毒高粘膜免疫水平弱毒疫苗株NDV/LX及反向遺傳構建系統

有效

• 申請號: 201210000685.0
• 申請日: 2012-01-04
• 公開（公告）號: CN102559607A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 劉秀梵;劉曉文;王曉泉;胡順林;劉文博;劉慧謀
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/45;C12R1/93
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及分子生物學技術和免疫學技術，篩選一株能同時在消化道和呼吸道產生高水平粘膜免疫的基因I型新城疫病毒弱毒株NDV/LX，用于制造疫苗。

背景技術

新城疫病毒(Newcastle?disease?virus，NDV)是嚴重危害世界養禽業的重要傳染性病原體之一，可以感染多種禽類，常導致養禽業產生巨大的經濟損失[Alexander，D.J.2001.GordonMemorial?Lecture.Newcastle?disease.Br?Poult?Sci?42：5-22.]。該病毒屬于副粘病毒科、副粘病毒亞科、禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)的成員[Mayo，M.A.2002.Virus?taxonomy-Houston?2002.Arch?Virol?147：1071-1076.]。新城疫病毒有囊膜，基因組為單股、負鏈、不分節段的RNA病毒，基因組結構模式為：3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次編碼6種結構蛋白：核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白(NP)，P，M，F，HN和L蛋白。

根據對雞的毒力，NDV毒株可以為強毒(Velogenic)、中等毒力(mesogenic)和弱毒(Lentogen)。已開展廣泛的試驗來闡明病毒致病性的分子決定因素[Huang?Z，KrishnamurthyS，Panda?A，Samal?SK.Newcastle?disease?virus?V?protein?is?associated?with?viral?pathogenesis?andfunctions?as?an?alpha?interferon?antagonist.Journal?of?virology?2003?Aug；77(16)：8676-85.]。大部分研究是關于F和HN蛋白對致病性的作用，研究結果一致認為F蛋白裂解位點處的氨基酸序列是病毒毒力的主要決定因素[Seal?BS.Nucleotide?and?predicted?amino?acid?sequence?analysisof?the?fusion?protein?and?hemagglutinin-neuraminidase?protein?genes?among?Newcastle?diseasevirus?isolates.Phylogenetic?relationships?among?the?Paramyxovirinae?based?on?attachmentglycoprotein?sequences.Funct?Integr?Genomics?2004Oct；4(4)：246-57.]。NDV毒力差異的分子基礎主要決定于F0蛋白的蛋白酶裂解位點的氨基酸序列，強毒的裂解位點有聚堿性氨基酸序列，其模式基序為112GR/K-R-Q-K/R-R-F117；弱毒的裂解位點則缺少聚堿性氨基酸序列，其模式基序為112-E/G-R/K-Q-E/G-R-L117。

自1926年發現新城疫(ND)以來，ND已發生了四次大的流行，而且每一次流行都有不同基因型的毒株出現，尤其是90年代之后出現了新的基因VII型NDV，給我國的養禽業造成了巨大的經濟損失。在控制疫病的過程中，使用疫苗是最有效最經濟的方法，新城疫的疫苗已使用了幾十年，由于ND疫苗的廣泛使用，此病已基本上得到了較好的控制，但是臨床上非典型ND的發生十分普遍，ND仍然成為威脅養禽業的主要疾病之一，也就是說，常規的疫苗對于NDV強毒的攻擊并不能提供理想的保護。從近十年來的ND流行特點來看，臨床上所分離到的NDV毒株大多數屬于基因VII型[Liu，X.F.，H.Q.Wan，X.X.Ni，Y.T.Wu，and?W.B.Liu.Pathotypical?and?genotypical?characterization?of?strain?of?Newcastle?disease?isolatedfrom?outbreaks?in?chicken?and?goose?flocks?in?some?regions?of?China?during?1985-2001.ArchivesofVirology，2003，148(7)：1387-1403.]，而常規的ND疫苗株的基因型主要為I和II型(如V4、La?Sota等)，因此，在遺傳距離上當前NDV分離株與常規ND疫苗株相差較遠。